Name: Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a quantificar estruturas externas de Drosophila adulta com um protocolo de imagem de baixo custo e alta resolução. Este método acessível substitui a microscopia eletrônica para estudar defeitos de crescimento e padrão em olhos de mosca.

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1. Coleta e fixação de Drosophila adulta
<ol>
	<li>Configure cruzamentos de Drosophila ou cepas selecionadas e coloque-as em frascos contendo comida para moscas. Incubar os frascos para injetáveis à temperatura desejada (geralmente 25 °C) até que as moscas se desenvolvam e os adultos se fechem (~10-14 dias a 25 °C).</li>
	<li>Anestesie as moscas com CO2 e coloque-as em uma almofada de CO2 .</li>
	<li>Separe as moscas com uma pena e selecione os indivíduos com o fenótipo desejado (por exemplo, asas retas). Faça um classificador de moscas de penas aparando uma pena de ganso para caber na extremidade cônica de uma pipeta sorológica de 1 mL.</li>
	<li>Prepare um tubo de microcentrífuga de 1,7 mL com 1 mL de etanol a 70%. Coloque as moscas selecionadas no tubo de microcentrífuga e coloque no gelo. Armazene os tubos da microcentrífuga a 4 °C durante a noite (Figura 2A). NOTA: Não conserve moscas em etanol por mais de 24 h. O armazenamento prolongado de moscas em etanol a 70% resultará em perda de pigmento dos olhos e do corpo.</li>
</ol>
2. Preparação da amostra por montagem pontual
NOTA: Drosophila são insetos de corpo mole que se tornam quebradiços e colapsam quando secos ao ar; portanto, este protocolo exige que as amostras sejam fotografadas no mesmo dia em que são montadas. Trabalhe em pequenos conjuntos de ~5 moscas de cada vez para evitar a perda de amostra. Aumente o número de amostras em um conjunto com base na eficiência. Espécimes que requerem mais tempo antes da imagem podem ser desidratados por meio de uma série de concentrações crescentes de hexametildisilazano (HMDS)14.
<ol>
	<li>Corte pequenas pontas triangulares (7,1 mm x 2,7 mm) de cartolina de arquivo de 65 lb usando um punção de ponta especializado. Prepare os pontos dobrando a ponta (25% mais estreitos) em um ângulo de 90° com uma pinça de ponta fina Dumont #5 (Figura 2B).</li>
	<li>Usando a pinça de ponta fina Dumont #5, remova as moscas dos tubos da microcentrífuga (etapa 1.4). Seque suavemente as moscas com tecido de laboratório sem fiapos para remover o excesso de etanol. Posicione cada mosca do lado esquerdo em um cartão de índice sob um microscópio de dissecação. NOTA: Remova as moscas do tubo segurando uma estrutura anatômica que não seja a área de interesse - ao obter imagens da cabeça, seguramos as amostras pela asa ou perna. Não segure as amostras pelo abdômen, pois essa estrutura é usada para colar a mosca na ponta do cartão.</li>
	<li>Prepare a cola para pele, ajustando sua consistência à viscosidade desejada. Misture 1-2 gotas de cola de couro com 1-2 gotas de água deionizada (DI) e misture com uma pipeta de transferência em um cartão de índice. Pegue uma ponta de cartão preparada na extremidade larga com uma pinça e coloque uma pequena quantidade de cola diluída na ponta dobrada da ponta, esfregando-a na mistura de cola e água (Figura 2C). NOTA: A cola deve ser espalhada, mas não escorrendo.</li>
	<li>Aplique a ponta dobrada da ponta na face anterior do abdômen direito ao redor dos segmentos abdominais 2-3 (Figura 2C). Antes que a cola seque, faça pequenos ajustes na mosca, de modo que o eixo ântero-posterior da mosca fique perpendicular à ponta dobrada da ponta.</li>
	<li>Insira um pino de montagem nº 3 na extremidade larga da ponta do cartão (Figura 2D) e prenda-o a um bloco de fixação de insetos (Figura 2E). Rotule cada alfinete ou linha de alfinetes com o genótipo correspondente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
Figura 2: Preparação da amostra. (A) Drosophila adulta são classificadas com base em marcadores fenotípicos e coletadas em tubos de microcentrífuga rotulados contendo 70% de etanol em gelo. As moscas são armazenadas a 4 ° C durante a noite. (B) As pontas do cartão de papel são preparadas dobrando a extremidade estreita 90 ° do resto do cartão usando um par de pinças # 5. (C) As moscas são recuperadas dos tubos e deixadas secar brevemente ao ar. A cola de couro é aplicada na extremidade pequena e dobrada da ponta do cartão preparada e colada na mosca adulta nos segmentos abdominais 2-3. (D) As amostras são montadas, com uma etiqueta de identificação, em um pino de inseto de aço inoxidável # 3. (E) As amostras fixadas são armazenadas em uma placa de amostra até que estejam prontas para aquisição de imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. Aquisição de imagens de empilhamento de foco de alta resolução
<ol>
	<li>Adquira fotografias de alta resolução de olhos de mosca com um sistema de imagem de empilhamento de foco montado e personalizado, montado e personalizado.<ol>
		<li>Capture fotografias com um corpo de câmera DSLR com uma lente telefoto de 70-200 mm conectada a uma objetiva de microscópio Apo 20x por meio de um adaptador de lente de 77 mm.</li>
		<li>Certifique-se de que a amostra esteja iluminada com um flash através de um difusor (Figura 3).</li>
		<li>Controle o posicionamento Z usando um controlador Stackshot e um trilho macro.</li>
		<li>Conecte a câmera, o flash e o estágio motorizado a um tripé de alumínio anodizado resistente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posicione cada amostra montada em um gimbal de platina universal com a cabeça orientada de forma que o olho fique voltado para a lente. Faça ajustes na posição da cabeça movendo suavemente a cabeça com a pinça. CUIDADO: Ajustes grandes e rápidos podem resultar em decapitação acidental.</li>
	<li>Com a câmera conectada a um laptop, ajuste as configurações de aquisição no software. Fotografe espécimes com ampliação de 20x com estas configurações: Potência do flash 1/32, Velocidade do obturador 1/200, Abertura F2.8 e ISO 400. Certifique-se de que todos os recursos de foco automático e estabilização de imagem estejam desativados. NOTA: Essas configurações equilibram a iluminação ideal do flash, a velocidade do obturador e a profundidade de campo. Eles precisariam ser ajustados para outras ampliações e/ou combinações de lentes.</li>
	<li>Defina o local para salvar a pilha de imagens resultante (10 a 50 imagens) na pasta de arquivos desejada. Garanta capacidade de armazenamento suficiente para as imagens (~8,5 MB por imagem).</li>
	<li>Ajuste as configurações da pilha de foco na unidade de controle Stackshot no modo Distância automática .<ol>
		<li>Defina o tamanho do passo para 5 μm e calcule o número de passos definindo as posições inicial e final da pilha de foco.</li>
		<li>View a amostra no modo LiveView e com a câmera no modo de disparo automático para identificar as posições de início e parada.</li>
		<li>Mova o trilho para que a parte mais próxima da amostra esteja em foco (defina a posição inicial ) e, em seguida, mova-se para onde a característica de interesse mais distante esteja em foco (defina a posição final ).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Retorne a câmera para o modo de disparo manual e inicie a aquisição de imagem a partir da unidade de controle Stackshot. NOTA: O tempo de aquisição da imagem depende do tamanho da amostra. Quanto maior a profundidade de campo necessária para espécimes grandes, mais fatias são incluídas na pilha de imagens, o que estenderá o tempo geral de aquisição.</li>
	<li>Abra arquivos no software de empilhamento de foco referenciado. Gere uma imagem empilhada clicando em Pilha | Alinhar &amp; Empilhar Tudo (PMax).</li>
	<li>Salve a imagem final no disco rígido do computador como um arquivo .tif clicando em Arquivo | Salve a imagem de saída. NOTA: Dependendo da resolução do arquivo de imagem empilhado e do número de espécimes fotografados, discos rígidos externos grandes (1 TB) podem ser necessários para o backup da imagem. Nesse protocolo, as imagens empilhadas têm aproximadamente 100 MB cada antes de serem compactadas.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
Figura 3: Aquisição de imagem. (A) Aparelho de imagem com partes rotuladas da seguinte forma: a) Corpo da câmera DSLR; b) lente teleobjetiva; c) Objetiva e Adaptador para Microscópio Apo 20x; d) Flash; e) Difusores de Lentes e Dome; f) Controlador Stackshot, Macro Rail e Estágio Rotativo; g) Gimbal de Palco Universal; h) Tripé. (B) Aparelho de imagem com difusor de luz instalado. (C) Close-up da amostra montada em posição para imagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
4. Fluxo de trabalho de análise FIJI para calcular a área dos olhos adultos
<ol>
	<li>Para análise de imagens, obtenha o software FIJI15 no site da ImageJ.net.</li>
	<li>Escolha imagens para análise em que o olho esteja centralizado e alinhado com iluminação adequada e desfoque periférico mínimo, indicando o alinhamento adequado com a câmera.</li>
	<li>Calibre a escala da imagem.<ol>
		<li>Baixe a imagem da barra de escala para ampliação de 20x que se correlaciona com 500 μm. Como alternativa, no momento da aquisição da imagem, fotografe uma régua usando as mesmas configurações. Abra a imagem no FIJI Software.</li>
		<li>Meça o comprimento da barra de escala (Figura 4A). Use a ferramenta Linha reta para traçar exatamente a linha. Clique em Analisar | Medir. Esta distância de pixel é equivalente a 500 μm (Figura 4B).</li>
		<li>Calcule pixels por mícron. Use isso para converter medições de pixel em medições de micrômetro.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem empilhado em FIJI (Figura 4C).</li>
	<li>Selecione Lupa na barra de ferramentas para ampliar a área de foco. Tente preencher a tela com o olho e a cutícula da cabeça imediatamente ao redor (Figura 4D).</li>
	<li>Selecione Ferramenta de seleção à mão livre na barra de ferramentas. Contorne a área retiniana o mais próximo possível, seguindo os contornos da fileira mais externa de omatídeos (Figura 4E). Para remover parte da seleção, mantenha pressionado o botão de opção e selecione os pixels a serem removidos. Para adicionar à seleção, mantenha pressionados os botões option e shift e selecione os pixels a serem adicionados.</li>
	<li>Para calcular a área, selecione Analisar | Meça no menu superior (Figura 4F). Uma nova janela aparecerá com os parâmetros área, média, mínimo e máximo . Copie e cole esses dados em uma planilha para documentação e conversão de pixels para medições de micrômetros.</li>
	<li>Realize análises estatísticas apropriadas.</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
Figura 4: Análise de imagem em FIJI. (A) Dimensione a imagem original. Baixe a imagem de calibração e meça o comprimento da barra de 500 μm. (B) Ajuste a escala usando a função Set Scale . (C) Abra a imagem empilhada. (D) Amplie a imagem para que o olho fique centralizado e quase em tela cheia. (E) Use a ferramenta Seleção à mão livre para delinear o olho na borda entre a fileira mais externa de omatídeos e a cutícula circundante. (F) A medida da área dentro da região selecionada é calculada clicando em Analisar | Medida | Área. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<meta charset="utf8"></head><body>Imagens de alta resolução e análise de defeitos oculares de Drosophila

<ol><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+models+of+invasive+tumorigenesis+for+in+vivo+studies+on+tumour%2Fperipheral+host+tssue+interactions+during+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).</li>
<li>Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+in+cancer%3A+mechanistic+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila.</a> Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).</li>
<li>Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+Drosophila+genetics+and+its+insight+into+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease.</a> Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclaiming+Warburg%3A+using+developmental+biology+to+gain+insight+into+human+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases.</a> Development. 147 (11), dev189340(2020).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Johnson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexagonal+patterning+of+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hexagonal patterning of the Drosophila eye.</a> Dev Biol. 478, 173-182 (2021).</li>
<li>Weasner, B. P., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+history+of+the+eye-antennal+disc+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 221 (1), iyac041(2022).</li>
<li>Pichaud, F., Casares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+an+optical+dome%3A+The+size+and+shape+of+the+insect+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).</li>
<li>Oster, I. I., Crang, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Drosophila+mutant+and+wild+type+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes.</a> Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).</li>
<li>Gibb, T. J., Oseto, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+TJ+%22Insect+collection+and+identification%3A+Techniques+for+the+field+and+laboratory%22">Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+cost+compact+cameras+with+focus+stacking+functionality+in+entomological+digitization+projects%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects.</a> ZooKeys. 712, 141-154 (2017).</li>
<li>Brown, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+chemical+alternative+to+critical-point-drying+for+preparing+small+%28or+large%29+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+Times%22%5BJournal%5D)">A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies.</a> Fly Times. 11, 10(1993).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 4, e03270(2015).</li>
<li>White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+behaviors+mediated+by+dysregulated+pH+dynamics+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance.</a> J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).</li>
<li>Peralta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Nhe2+overexpression+induces+autophagic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death.</a> Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).</li>
<li>Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+A+platform+for+anticancer+drug+discovery+and+personalized+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies.</a> Front Genet. 13, 949241(2022).</li>
<li>Nitta, Y., Sugie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+neurodegenerative+diseases+using+Drosophila+and+the+development+of+novel+approaches+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis.</a> Fly. 16 (1), 275-298 (2022).</li>
<li>Pletcher, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+using+the+Drosophila+melanogaster+TRiP+RNAi+collection+to+identify+metabolic+enzymes+required+for+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).</li>
<li>Bangi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+platform+identifies+trametinib+plus+zoledronate+for+a+patient+with+KRAS-mutant+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer.</a> Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).</li>
</ol>

Drosophila melanogaster é um poderoso organismo modelo genético que tem sido usado há décadas para elucidar vias de sinalização molecular e comportamentos celulares. Muitas das vias de sinalização evolutivamente conservadas que são essenciais para o desenvolvimento multicelular foram identificadas pela primeira vez e seu mecanismo de ação definido em Drosophila. Cerca de 65-75% de todos os genes associados a doenças humanas têm ortólogos em Drosophila 1,2. O olho adulto de Drosophila é um modelo importante que permitiu triagens genéticas imparciais que facilitaram a descoberta de importantes genes conservados implicados em doenças humanas, incluindo câncer 3,4, neurodegeneração5 e distúrbios metabólicos6.
O olho da Drosophila é composto por ~ 800 olhos unitários, denominados omatídeos, que são precisamente dispostos em um padrão hexagonal na superfície do olho adulto7. Cada omatídio é composto por oito neurônios fotorreceptores que ocupam uma localização distinta dentro de um trapézio assimétrico. Estes são suportados por quatro células cone não neurais e duas células de pigmento primário que secretam lente e pseudo-cone para focalizar a luz nos rabdômeros sensíveis à luz dos neurônios fotorreceptores. Os omatídeos vizinhos são separados por uma única fileira de células de rede interommatidial, compostas por células pigmentares secundárias, células pigmentares terciárias e complexos de cerdas mecanossensoriais 8,9,10.
Perturbações no desenvolvimento ocular são visíveis em olhos adultos como aumento ou diminuição do tamanho do olho, abundância anormal ou estrutura de lentes ou cerdas, ou como um "olho áspero" onde o padrão hexagonal normalmente invariante é interrompido de tal forma que uma fileira de omatídeos não pode mais ser seguida pela superfície do olho. Esses fenótipos podem ser pontuados no nível do tecido macroscópico usando microscópios de dissecação. A análise detalhada dos fenótipos tradicionalmente inclui microscopia eletrônica de varredura seguida de análise quantitativa de imagens11. No entanto, a microscopia eletrônica de varredura requer instrumentação cara, reagentes caros, preparação de amostras que se estende por dias e, muitas vezes, equipe em tempo integral para manter.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho para imagens de estruturas de Drosophila adultas. (A) Colete e fixe Drosophila adulta em etanol 70%. (B) Prepare amostras para imagem por montagem pontual e fixação em pinos. (C) Adquira imagens de alta resolução por meio de empilhamento e integração de foco. (D) Quantificar imagens usando FIJI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Este artigo apresenta um fluxo de trabalho relativamente barato, tem um tempo de preparação de amostra curto, pode ser facilmente configurado em uma bancada de laboratório de 3 pés, não requer materiais perigosos e pode ser uma adição de longa duração aos laboratórios de pesquisa de Drosophila (Figura 1). A montagem pontual é uma técnica entomológica usada para secar ao ar e preservar insetos pequenos e de corpo mole, como Drosophila12. Este método baseia-se na combinação de objetivas de microscópio com câmeras DSLR de alta resolução para ampliações efetivas de 10x a 1.000x. A profundidade de campo limitada inerente à macrofotografia é superada pelo empilhamento de foco: costurando uma série de imagens com o plano focal se movendo através da amostra de interesse13. Este método produz imagens de alta resolução adequadas para a quantificação de fenótipos e pode ser facilmente adaptado para outras estruturas de interesse, como asa, perna, tórax e abdômen. O fluxo de trabalho de análise de imagem usa o programa gratuito de análise de imagem FIJI (NIH ImageJ). Essa metodologia torna a preparação de amostras, imagens de alta resolução e análises acessíveis para estudantes de graduação e cientistas em instituições com poucos recursos.

<table><tbody><tr><td>Pipeta sorológica de 1 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,7 mL</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x Objetiva de Microscópio Apo</td><td>Mitutoyo Corp.</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>Arquivo de cartão de 65 lb&nbsp;</td><td>Neenah, Inc.</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Canon EF 70-200 mm USM II lente telefoto</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II Corpo da Câmera DSLR</td><td>Canon</td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>Difusor Dome</td><td>Soluções Macroscópicas&nbsp;</td><td>Difusor PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>para Mitutoyo M Plan APO Objectives</td> Soluções <td>Macroscópicas&nbsp;</td><td>mitutoyo-difusores</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila ampolas e plugues</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pinças de ponta fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>Penas de ganso</td><td>Amazon</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>Tripé de alumínio anodizado resistente</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>tecido de laboratório sem fiapos</td></tr><tr><td>Câmera digital Levenhuk M1000 Plus</td><td>Pino de montagem Levenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>No. 3</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington Drosophila media</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>66-113</td><td>comida para moscas</td></tr><tr><td>Point-Punch</td><td>MC Mieth Manufacturing, Inc.</td><td>448Detalhe</td><td></td></tr><tr><td>Screwknob Clamp</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>Para prender o trilho macro ao tripé</td></tr><tr><td>Stackshot Controller e Macro Rail</td><td>Cognisys Inc.</td><td></td><td></td>ST3X_100_BUNDLE</tr><tr><td>Adaptador de Anel Abaixador&nbsp;</td>Adaptador <td>de lente de 763461174207</td> <td>de câmera RAF</td><td>para conectar a objetiva do microscópio à lente da câmera</td></tr><tr><td>Cola Titebond</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (v. 3.16.1).&nbsp;</td>O <td>software de aquisição</td> <td>da Canon</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Fiji é lançado como código aberto sob a GNU General Public License.&nbsp; Versão 2.14.0/1.54f da FIJI;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts EUA</td><td></td><td>Prism Versão 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td><td>Zerene Systems, LLC</td><td></td><td>Focus Stacking Software</td></tr></tbody></table>

um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de drosophila adulta

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

O olho de Drosophila é um excelente sistema modelo para estudar padrões de tecidos, controle de crescimento e morte celular. Recentemente, publicamos um estudo investigando como o pH intracelular (pHi) influencia o crescimento do tecido. Primeiro, estabelecemos um sistema genético em que a superexpressão do trocador de sódio-prótons DNhe2 (o ortólogo do NHE1 de mamíferos) no olho em desenvolvimento causa defeitos de padronização e aumento da proliferação16. O aumento da proliferação com maior pHi é observado em todas as espécies, de leveduras a mamíferos17. No entanto, também observamos que, com o aumento do pHi, o olho adulto parecia menor em tamanho em comparação com os controles.
A análise quantitativa da área do olho adulto foi feita para determinar como a expressão elevada de DNhe2 diminui o tamanho do tecido no olho de Drosophila . Primeiramente, adquirimos imagens de baixa resolução usando um microscópio de inserção ocular (Figura 5A), mas estas eram de qualidade insuficiente para realizar medidas quantitativas. Especificamente, as bordas do olho não estão em foco, impedindo assim uma medição precisa da área dos olhos.
Medimos a área de cada olho em imagens de alta resolução de olhos adultos de Drosophila (Figura 5B). As moscas que expressam GMR&gt;DNhe2 tinham olhos significativamente menores (média de 74,28 μm2) do que as moscas de controle genético w1118 (média de 125,83 μm2) ou o controle condutor GMRGAL4 moscas heterozigóticas (média de 142,49 μm2), o que representa uma redução de 41% e 48% na área, respectivamente (Figura 5C). Essa diminuição no tamanho do olho, apesar do aumento da proliferação, pode ser atribuída a níveis elevados de morte celular.
Genes de autofagia conhecidos, incluindo Atg1, que induz a formação de fagóforos, foram usados em estudos de interação genética (Figura 5). Os efeitos no tamanho do olho adulto foram quantificados usando fotografia de alta resolução e análise de área (Figura 5B). O tamanho do olho foi restaurado (129,9 μm2 vs 74,28 μm2) em moscas GMR&gt;DNhe2 heterozigotas para Atg13 em comparação com GMR&gt;DNhe2 sozinho e foi semelhante aos controles (Figura 5C). Combinado com a análise de marcadores moleculares, nossos resultados apóiam o aumento da morte celular autofágica em pHi mais alto.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
Figura 5: Resgate da diminuição do tamanho da retina associada ao aumento do pH intracelular com diminuição da autofagia. (A) Imagens de baixa resolução de olhos de moscas adultas tiradas com um microscópio de inserção ocular. (B) Imagens de alta resolução de olhos de moscas adultas usadas para quantificação do tamanho dos olhos para os seguintes genótipos: w1118; GMRGAL4; GMR&gt;DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR&gt;DNhe2; Atg13. (C) Os tamanhos médios dos olhos adultos medidos foram: w1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) e GMR&gt;DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR&gt;DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) e indicado por mostrar valores medianos com intervalos interquartis. A significância estatística foi determinada por testes t não pareados com correção de Welch. Os dados em B e C foram publicados anteriormente18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Nossas conclusões são reforçadas pela preparação da amostra, imagens de alta resolução e a análise descrita aqui. Esses métodos permitiram uma descrição precisa e quantitativa do tamanho dos olhos adultos de Drosophila com vários genótipos. Continuamos a usar essa abordagem para avaliar outras interações genéticas que elucidarão os mecanismos de controle de crescimento dependente do pH.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os músculos de vôo da Drosophila são usados como um sistema modelo para o desenvolvimento e fisiologia muscular. Este vídeo descreve a musculatura de voo de adultos e destaca um protocolo para dissecar o desenvolvimento de músculos de voo indireto que são adequados para o sequenciamento de RNA de pupas.

drosófila Dissecção do músculo de voo indireto (IFM) da pupa tardia: um método para coleta de tecido de alto rendimento

Morfologia, tamanho e localização das organelas intracelulares são evolutivamente conservados e parecem afetar diretamente sua função. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes a esses processos tornou-se um objetivo importante da biologia moderna. Aqui mostramos como esses estudos podem ser facilitados pela aplicação de técnicas quantitativas.

Por Quantificação Matérias: Caracterização de fenótipos na<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval Junção Neuromuscular

O adulto de Drosophila cérebro é um sistema valioso para estudar circuitos neuronais, funções cerebrais superiores, e doenças complexas. Um método eficiente para dissecar tecido do cérebro inteiro do cabeça pequena mosca facilitará estudos baseados em cerebrais. Aqui nós descrevemos um de uma etapa simples protocolo, dissecação de cérebros adultos com morfologia bem preservada.

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Dois algoritmos de análise de imagem, "Drosophila MNJ morfometria" e "Drosophila MNJ Bouton morfometria" foram criados, para quantificar automaticamente nove características morfológicas da junção neuromuscular Drosophila (MNJ).

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Este trabalho apresenta um método para quantificar rápida e precisamente a pigmentação abdominal de Drosophila melanogaster usando a análise de imagem digital. Este método simplifica os procedimentos entre aquisição de fenótipo e análise de dados e inclui montagem de espécimes, aquisição de imagem, extração de valor de pixel e medição de características.

Quantificando pigmentação abdominal em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

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Avaliando a Habilidade Fagocítica Específica da Idade dos Hemócitos de Melanogaster Drosophila Adulto usando um Ensaio de Faagocitose In Vivo

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O sistema ocular de Drosophila é uma ferramenta útil para estudar vários processos biológicos, particularmente doenças neurodegenerativas humanas. No entanto, a quantificação manual de fenótipos de olhos ásperos pode ser tendenciosa e não confiável. Aqui descrevemos um método pelo qual ilastik e Flynotyper são usados para quantificar o fenótipo ocular de forma imparcial.

Quantificando os fenótipos oculares de Drosophila melanogaster : uma abordagem computacional integrando ilastik e Flynotyper

A hibridização in situ de fluorescência iterativa assistida por expansão (EASI-FISH) é uma técnica robusta que combina microscopia de expansão com hibridização in situ de fluorescência (FISH) para detectar a expressão de vários genes em tecidos espessos. Este protocolo descreve os recentes avanços no método e sua adaptação para rotular o sistema nervoso central intacto da Drosophila.

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Aprenda a quantificar estruturas externas de Drosophila adulta com um protocolo de imagem de baixo custo e alta resolução. Este método acessível substitui a microscopia eletrônica para estudar defeitos de crescimento e padrão em olhos de mosca.

Um fluxo de trabalho rápido e simples para quantificação de estruturas externas de Drosophila adulta

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