Sistemas de Modelo de Tecido Organotípico para Investigação de Interações Patógeno-Hospedeiro In Vitro

Os biofilmes de platina dentária são compostos por centenas de microrganismos que podem causar inflamação no epitélio oral, levando a doenças como a gengivite. Queremos entender melhor essas interações, usando modelos de tecidos organotípicos. Esses sistemas fornecem plataformas úteis para avaliar modalidades alternativas de tratamento de maneira controlada.

Portanto, o avanço das tecnologias de sequenciamento nos últimos anos está transformando o campo da biologia da infecção. Essas tecnologias nos permitem investigar verdadeiramente as interações do patógeno hospedeiro, usando várias técnicas OMICs por meio da avaliação das assinaturas do hospedeiro e microbianas em nível proteômico, transcriptômico e metabolômico. Nossa pesquisa recente destacou a importância das interações inter-reinos e polimicrobianas em infecções relacionadas ao biofilme.

Por meio do uso de sistemas modelo in vitro, conseguimos investigar as interações do biofilme do hospedeiro, testar novas terapias anti-biofilme e traçar o perfil das comunidades microbianas, usando tecnologias inovadoras como RAM e espectroscopia. Estudos futuros, usando esses modelos de tecido organotípico, terão como objetivo obter uma assinatura multi-OMIC e perfil do microrganismo e do tecido e cultura do hospedeiro, juntos. Esperamos descobrir e desvendar interações complexas entre o hospedeiro e bactérias e espécies fúngicas específicas em nossos modelos de biofilme.

Para começar, remova os talos congelados de contas porosas contendo espécies de estreptococos de 80 graus Celsius. Reviva espécies de estreptococos em placas de base de trado de sangue Columbia, contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado estéril. Incube as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.

No dia seguinte, transfira três a quatro colônias do prato para 10 mililitros de meio de caldo de soja triptona. Cultive o caldo a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 a 18 horas. Após a incubação, centrifugar as suspensões celulares a 3 000 g durante cinco minutos a 20 graus Celsius.

Lave os pellets celulares com 10 mililitros de PBS estéril. Ressuspenda os pellets em 10 mililitros de PBS e padronize a suspensão de cada espécie de estreptococo, individualmente, usando um espectrofotômetro ajustado para 550 nanômetros. Após a padronização, dilua cada suspensão de estreptococos, um a 10, para atingir uma concentração de um vezes 10 elevado a sete células por mililitro em uma mistura de um para um de caldo Todd Hewitt e meio do Roswell Park Memorial Institute.

Pipetar 500 microlitros de suspensões de células diluídas para uma placa de microtitulação de 24 poços, contendo um disco de hidroxiapatita de 13 milímetros. Incube a cultura por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para permitir a formação de biofilme. De maneira semelhante, cultura para microrganismos anaeróbicos em uma base de trado anaeróbico fastidioso, contendo 5% de sangue de cavalo desfibrinado estéril.

Padronize cada microrganismo anaeróbico para uma absorbância específica e dilua-os em uma mistura individual de caldo Todd Hewitt e meio do Roswell Park Memorial Institute. Após a maturação do biofilme estreptocócico, remova cuidadosamente as células não aderidas e os meios gastos dos poços. Adicione 500 microlitros de um vezes 10 padronizado à potência de sete células por mililitro suspensões de quatro microrganismos anaeróbicos em cada poço.

Incubar os biofilmes por 24 horas em condições anaeróbicas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova as células não aderidas e os meios gastos dos poços. Adicione 500 microlitros de mistura estéril de caldo Todd Hewitt e meio do Roswell Park Memorial Institute.

Cultivar os biofilmes em condições anaeróbias durante 24 horas. No sétimo dia, lave os biofilmes duas vezes com 500 microlitros de PBS estéril para co-cultura. Para começar, desembale e transfira o epitélio oral humano ou tecido e meio HOE para uma cabine de segurança de classe dois.

Adicione um mililitro do meio de manutenção fornecido com o tecido a cada poço de uma placa de 12 poços. Usando uma pinça estéril, remova as inserções de policarbonato contendo o tecido HOE do sem-fim nutritivo e da placa de transporte de 24 poços. Transfira o tecido para a placa de 12 poços preparada.

Incube os modelos de tecido por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para aclimatá-los às condições de laboratório. Enquanto isso, para remover os biofilmes dos discos de hidroxiapatita, use uma agulha de calibre 19 e uma pinça para levantar os discos do fundo da placa de 24 poços. Transfira os discos para uma bijuteria, contendo um mililitro de DPBS estéril.

Sonicar os discos a 35 kilohertz durante 10 minutos em banho-maria de sonicação. Após a aclimatação, use uma pinça para remover as inserções de tecido da placa de 12 poços. Pipetar 100 microlitros da suspensão de sonicada de biofilme diretamente nos modelos de tecido.

Transfira as pastilhas para outra placa de 12 poços contendo um mililitro de meio de manutenção fresco. Incube os modelos de tecido por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Para o processamento de tecidos, prepare 350 microlitros de tampão de lise RLT, contendo 1% de mercaptoetanol em um tubo de anel de vedação com tampa de rosca de dois mililitros.

Adicione aproximadamente 100 microlitros de esferas de vidro lavadas com ácido de 0,5 milímetro ao tubo. Usando uma pinça, remova as inserções contendo o tecido da mídia e descarte qualquer suspensão microbiana restante da inserção. Segure a pastilha invertida ao nível dos olhos e, em seguida, use uma agulha de calibre 19 para cortar cuidadosamente o tecido e a membrana da parte inferior da pastilha.

Transfira o tecido e a membrana para o tampão RLT preparado. Homogeneizar o tecido por 30 segundos, usando um homogeneizador de beader de bancada. Extraia o RNA do lisado resultante, seguindo as instruções do kit de extração de RNA do fabricante.

Colete os meios de tecido gastos restantes para análises proteômicas, usando metodologias de baixo e alto rendimento. A expressão gênica de biomarcadores inflamatórios no tecido HOE foi significativamente regulada positivamente após a exposição ao biofilme sonicate, em comparação com o controle não estimulado. As maiores mudanças de dobra foram observadas para CCL2, CXCL1 e CSF3.

A expressão de mRNA de IL8 no tecido HOE aumentou 8,67 vezes, após estimulação com sonicato de biofilme, em comparação com o tecido controlado. Os níveis de proteína IL8 no meio gasto aumentaram de 1,005 nanogramas por mililitro no tecido controle para 4,245 nanogramas por mililitro no tecido estimulado por sonicado de biofilme.