Name: Avaliação da deposição de ferro no cérebro de camundongos 5xFAD por coloração Perls/DAB (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a avaliar a deposição de ferro em cérebros de camundongos 5xFAD usando coloração Perls/DAB. Este protocolo demonstra detecção sensível e específica de ferro em modelos de doença de Alzheimer.

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<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+divalent+metal+transporter+1+enhances+iron+uptake+to+mediate+loss+of+dopaminergic+neurons+and+motoric+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of divalent metal transporter 1 enhances iron uptake to mediate loss of dopaminergic neurons and motoric deficit.</a> J Neurosci. 38 (39), 8364-8377 (2018).</li>
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<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+light+chain+interacts+with+pen-2+and+affects+%CE%B3-secretase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Ferritin light chain interacts with pen-2 and affects γ-secretase activity.</a> Neurosci Lett. 548, 90-94 (2013).</li>
<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
<li>Connor, J. R., Menzies, S. L., Martin, S. M. S., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+distribution+of+transferrin%2C+ferritin%2C+and+iron+in+normal+and+aged+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular distribution of transferrin, ferritin, and iron in normal and aged human brains.</a> J Neurosci Res. 27 (4), 595-611 (2004).</li>
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A doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais comum e tornou-se um sério problema para a sociedade. A prevalência de DA aumenta drasticamente com a idade 1,2,3,4. As principais características patológicas da doença de Alzheimer (DA) incluem a deposição de placas β-amilóides (Aβ) e emaranhados neurofibrilares (NFTs) devido à fosforilação aberrante das proteínas tau. Aβ é gerado através da clivagem sequencial da proteína precursora de amilóide (APP) pelas enzimas β-secretase e γ-secretase. A desregulação na produção ou depuração de Aβ leva ao seu acúmulo no cérebro, formando placas amilóides, que são reconhecidas como um dos primeiros marcadores patológicos da DA. Essas placas não apenas causam danos neuronais diretos, mas também iniciam uma cascata de efeitos prejudiciais, incluindo neuroinflamação, estresse oxidativo e disfunção sináptica. Coletivamente, esses processos contribuem para a morte neuronal e o declínio cognitivo progressivo observado noAD 5. Apesar de décadas de pesquisa visando predominantemente as características patológicas da doença de Alzheimer (DA), incluindo deposição de placa β amilóide e agregação hiperfosforilada da proteína tau, avanços terapêuticos clinicamente significativos permanecem indescritíveis, com intervenções existentes demonstrando eficácia limitada na modificação da progressão da doença6.
O ferro é um metal importante para manter a função cerebral e está envolvido no transporte de oxigênio, síntese de DNA, respiração mitocondrial, síntese de mielina, síntese de neurotransmissores e metabolismo. No entanto, o ferro torna-se nocivo quando as concentrações excedem a capacidade de sequestro celular 6,7,8. Aumento da deposição de ferro, geralmente co-localizado com placas Aβ, foi observado nas regiões cortical e hipocampal do cérebro em pacientes com DA 9,10. Através da reação de Fenton11, o ferro livre intracelular pode gerar radicais hidroxila (•OH), bem como espécies reativas de oxigênio. Essas substâncias nocivas não apenas induzem neuroinflamação ativando as células gliais, mas também atacam as biomoléculas da célula por meio do estresse oxidativo, interrompendo a função celular normal e levando à disfunção sináptica 8,12. Além disso, o aumento do ferro está diretamente envolvido no desenvolvimento de sinais patológicos da DA: o ferro contribui para a produção de Aβ12 e também aumenta a disfunção da proteína tau, levando a emaranhados neurofibrilares13.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para avaliar o conteúdo de ferro no cérebro, incluindo ressonância magnética (RM), bem como métodos químicos e histoquímicos14. A quantificação in vivo dos níveis de ferro intracerebral por meio da RM é clinicamente importante para pacientes idosos e neurodegenerados15. A ressonância magnética tem a vantagem de ser não invasiva e altamente sensível: pode detectar a deposição de ferro nos estágios iniciais da doença. Em particular, a técnica de aumento de R2 dependente de campo (FDRI) pode distinguir entre diferentes formas de ferro, como ferritina ferro e heme-ferro16. No entanto, a RM não consegue detectar o acúmulo de ferro no nível celular e é cara, por isso é usada principalmente em investigações clínicas17.
A medição colorimétrica é um método químico que determina a concentração de uma substância (como o ferro) medindo a intensidade da cor produzida pela reação da substância em solução com um agente cromogênico18. Esse método é de fácil execução e utiliza reagentes e instrumentação de baixo custo, tornando-o adequado para laboratórios com orçamentos limitados18. No entanto, a precisão e a sensibilidade deste método são muito limitadas, pois os resultados estão sujeitos à influência de fatores ambientais, tempo de desenvolvimento da cor e julgamento subjetivo do operador. A espectrometria de absorção atômica com chama (FAAS) é outro método que pode ser usado para avaliar os níveis de ferro19. Neste método, uma solução de amostra clarificada é obtida queimando o tecido de interesse em um forno de alta temperatura. A amostra é então dissolvida com ácido clorídrico e a concentração de ferro na solução é determinada por espectrometria de absorção atômica. Este método é altamente sensível e adequado para todos os tipos de amostras biológicas19. No entanto, o processo é demorado e requer equipamentos caros, por isso seu uso é limitado.
A coloração de Perls / DAB para detectar ferro férrico não heme é o método de detecção de ferro mais comumente usado devido à sua alta especificidade e facilidade de implementação em comparação com outros métodos histoquímicos14. Ao contrário da análise colorimétrica, a coloração de Perls é um método de coloração histoquímica qualitativa que se baseia na reação entre íons de ferro e ferrocianeto de potássio para gerar um precipitado azul. É usado para visualizar microscopicamente a presença e distribuição de ferro nos tecidos. Além disso, este método permite distinguir a deposição de ferro em diferentes tipos celulares e observar a distribuição subcelular da deposição de ferro, fornecendo um método para o estudo doAD 20. A coloração de Perls detecta principalmente ferro férrico não heme e depende da formação do complexo azul da Prússia:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;">
(Azul da Prússia)
No entanto, a coloração tradicional de Perls é ineficaz para detectar a localização de ferro em baixos níveis de ferro. Quando a diaminobenzidina (DAB) é adicionada, ela reage com hexacianoferrato férrico para formar um composto marrom, aumentando a especificidade do ensaio21.
O objetivo deste protocolo é descrever como avaliar a quantidade e distribuição da deposição de ferro no cérebro de um modelo de camundongo com DA. Neste protocolo, camundongos transgênicos 5×FAD (C57BL/6J) de 8 meses de idade foram usados como modelo de camundongo AD e foram comparados com camundongos do tipo selvagem da mesma idade. Detalhes dos procedimentos para preparar o reagente químico, seccionar o cérebro, realizar a coloração de Perls / DAB e analisar as imagens tiradas após a coloração são apresentados aqui.

<table><tbody><tr><td>0.1 M PBS</td><td>biosharp</td><td>BL601A</td><td>Adicione água deionizada para fazer a solução</td></tr><tr><td>4% PFA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>Restaurar em 4 &deg; C para uso</td></tr><tr><td>20X DAB solução</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu; l solução A, 10 &mu; l solução B e 180 &mu; l</td></tr><tr><td>PBS Alcohol</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td><td>Adicione água destilada a 50 ml</td></tr> de <tr><td>cetamina&nbsp;</td><td>China National Medicines</td><td>H20193336</td><td>100 mg/kg para anestesiar</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>CX43</td><td></td></tr><tr><td>Composto de temperatura de corte ideal (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>solução de ferrocineto de potássio</td><td>Sigma</td><td>14038-43-8</td><td>Adicione água destilada a 50 ml</td></tr><tr><td>de sacarose</td><td>Sigma</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>xilazina& nbsp;</td><td>Biotecnologia YS-</td><td>(BC) -2842</td><td>de Y-S 15 mg/kg para anestesiar</td></tr><tr><td>Xilenos</td><td>Sigma</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação da deposição de ferro no cérebro de camundongos 5xfad por coloração perls/dab

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

Para investigar a distribuição e o acúmulo de ferro em um modelo de camundongo com DA, realizamos a coloração de Perls / DAB em fatias sagitais de camundongos 5xFAD de 8 meses de idade. Conforme mostrado na Figura 3, os sinais de coloração de Perls / DAB foram observados em camundongos 5xFAD e selvagens de 8 meses de idade e em camundongos selvagens de 2 meses de idade. Em camundongos 5xFAD, altos sinais de coloração Perls / DAB foram observados no hipocampo e no córtex, especialmente no sub...

Avaliação da deposição de ferro no cérebro de camundongos 5xFAD por coloração Perls/DAB

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Uma das características patológicas da doença de Alzheimer é a formação de amilóide β proteína placas neuríticas positivo. Neste protocolo, descrevemos dois métodos para detectar placas neuríticas em camundongos transgênicos modelo AD: detecção imunohistoquímica utilizando o método ABC e DAB e detecção fluorescente usando o método thioflavin S coloração.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Fonte: Mukherjee, K., et. al. análise de mitocôndrias cerebrais usando microscopia eletrônica de varredura serial de face de bloco. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra a preparação, imagem e análise de tecido cerebral de camundongo usando um microscópio eletrônico de varredura serial (SBFSEM) para visualizar a ultraestrutura mitocondrial, permitindo o mapeamento preciso de sua morfologia e distribuição espacial nos compartimentos neuronais axonais e dendríticos.

 Imagem de mitocôndrias neuronais usando um microscópio eletrônico de varredura serial de face de bloco

Este manuscrito descreve um procedimento para controlar a remodelação do cerebrovasculature durante amyloid acúmulo de placa in vivo utilizando microscopia de dois fótons longitudinal. Uma preparação crânio-diluídos permite a visualização de corantes fluorescentes para avaliar a progressão do dano vascular cerebral num modelo de rato da doença de Alzheimer.

Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagens do Cerebrovasculature: Relevância para doenças do SNC

Quantitativamente mapeamento metais no tecido por ablação a laser - indutivamente acoplado plasma - espectrometria de massa (LA-ICP-MS) é uma técnica analítica sensível que pode proporcionar uma nova visão sobre como os metais participar nos processos de função e doenças normais. Aqui, descrevemos um protocolo para imagiologia quantitativamente metais nas seções finas de tecido neurológico mouse.

Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)

Neste estudo, apresentamos um procedimento fácil e eficiente para avaliar o rompimento da barreira hemato - encefálica em condições neurodegenerativas. Para alcançar nosso objetivo, nós infundida de alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína rotulado (FITC)-albumina na jugular do mouse veia e avaliada a sua fuga para o parênquima cerebral por microscopia de fluorescência.

Avaliação da permeabilidade da barreira hemato - encefálica por infusão intravenosa de albumina FITC-etiquetadas em um modelo do rato da doença neurodegenerativa

Este protocolo descreve uma abordagem eficiente e reprodutível para estudos histológicos cerebrais do camundongo, incluindo perfusão, seção cerebral, imunostaining flutuante livre, montagem de tecido e imagem.

Imunostaining flutuante livre de cérebros de rato

Este artigo demonstra como preparar e administrar ferro isotópico não radioativo ligado à transferrina para estudos de transporte de ferro na gravidez de camundongos. A abordagem para quantificar o ferro isotópico em compartimentos fetoplacentários também é descrita.

Quantificando o transporte de ferro através da placenta de camundongo in vivo usando isótopos de ferro não radioativos

Aqui, é fornecido um protocolo para a medição do teor de ferro não heme em tecidos animais, utilizando um simples e bem estabelecido ensaio colorimétrico que pode ser facilmente implementado na maioria dos laboratórios.

Medição do teor de ferro não-heme do tecido usando um ensaio colorimétrico baseado em banhontrolina

O presente protocolo descreve e compara o procedimento para realizar uma análise de interesse de região completa ou sub-região de seções cerebrais de camundongos sagitos para quantificar a carga amilóide-beta no modelo de camundongo transgênico APP/PS1 da doença de Alzheimer.

Quantificação total versus sub-regional da carga amilóide-beta nas seções cerebrais do rato

O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

Modelagem de infecção vaginal ascendente, parto prematuro e morbidade neonatal em camundongos

Aprenda a avaliar a deposição de ferro em cérebros de camundongos 5xFAD usando coloração Perls/DAB. Este protocolo demonstra detecção sensível e específica de ferro em modelos de doença de Alzheimer.

Avaliação da deposição de ferro no cérebro de camundongos 5xFAD por coloração Perls/DAB

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