Name: Otimização da reação de transcrição in vitro para produção de mRNA usando monitoramento cromatográfico em linha (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a otimizar reações de transcrição in vitro para produção de mRNA usando monitoramento cromatográfico em linha. Este método permite acompanhar em tempo real o consumo de NTPs e maximizar o rendimento.

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<ol><li>Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+progress+of+mRNA+vaccines+and+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies.</a> Nat Biotechnol. 40, 840-854 (2022).</li>
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<li>Hengelbrock, A., Schmidt, A., Helgers, H., Vetter, F. L., Strube, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+mRNA+machine+for+regulatory+approval+of+variable+scale+between+1000+clinical+doses+to+10+million+manufacturing+scale+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Scalable mRNA machine for regulatory approval of variable scale between 1000 clinical doses to 10 million manufacturing scale doses.</a> Processes. 11, 745(2023).</li>
<li>Rosa, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mRNA+vaccine+production+with+Bayesian+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Maximizing mRNA vaccine production with Bayesian optimization.</a> Biotechnol Bioeng. 119 (11), 3127-3139 (2022).</li>
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<li>Pregeljc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yield+of+in+vitro+transcription+reaction+with+at-line+high+pressure+liquid+chromatography+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yield of in vitro transcription reaction with at-line high pressure liquid chromatography monitoring.</a> Biotechnol Bioeng. 120 (3), 737-747 (2023).</li>
<li>Kern, J. A., Davis, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+fed-batch+system+to+produce+RNA+by+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Application of a fed-batch system to produce RNA by in vitro transcription.</a> Biotechnol Prog. 15 (2), 174-184 (1999).</li>
<li>Skok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gram-Scale+mRNA+Production+Using+a+250-mL+Single-Use+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Chemie+Ingenieur+Technik%22%5BJournal%5D)">Gram-Scale mRNA Production Using a 250-mL Single-Use Bioreactor.</a> Chemie Ingenieur Technik. 94 (12), 1928-1935 (2022).</li>
<li>Welbourne, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anion+exchange+HPLC+monitoring+of+mRNA+in+vitro+transcription+reactions+to+support+mRNA+manufacturing+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Anion exchange HPLC monitoring of mRNA in vitro transcription reactions to support mRNA manufacturing process development.</a> Front Mol Biosci. 11, 1250833(2024).</li>
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<li>Matuszczyk, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raman+spectroscopy+provides+valuable+process+insights+for+cell-derived+and+cellular+products%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Raman spectroscopy provides valuable process insights for cell-derived and cellular products.</a> Curr Opin Biotechnol. 81, 102937(2023).</li>
<li>Mu, X., Hur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of in vitro-transcribed RNA.</a> Acc Chem Res. 54 (21), 4012-4023 (2021).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoporous+silica+particle+as+an+RNA+adsorbent+for+facile+purification+of+in+vitro-transcribed+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesoporous silica particle as an RNA adsorbent for facile purification of in vitro-transcribed RNA.</a> Int J Mol Sci. 24 (15), 12408(2023).</li>
<li>Ziegenhals, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dsRNA+by-products+during+in+vitro+transcription+can+be+reduced+by+using+low+steady-state+levels+of+UTP%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Formation of dsRNA by-products during in vitro transcription can be reduced by using low steady-state levels of UTP.</a> Front Mol Biosci. 10, 1291045(2023).</li>
<li>Höfer, K., Langejürgen, L. V., Jäschke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+aptamer-based+real-time+monitoring+of+enzymatic+RNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Universal aptamer-based real-time monitoring of enzymatic RNA synthesis.</a> J Am Chem Soc. 135 (37), 13692-13694 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m Filtro de membrana PES, p. ex. Sartolab BT 500</td><td>Sartorius</td><td>180E14---------E</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de plástico de 0,5 mL; por exemplo, DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td></td></tr><tr><td>tubos de plástico de 1,5 mL; por exemplo, DNA LoBind, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>ATP Solution</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R1331T2</tr><tr><td>Cooler de bancada -20 &deg; </td><td>Coluna</td> Analítica CIMac PrimaS <td>0.1</td> mL da Marca C 114935 <td></td></tr><tr><td>(2 &micro; m)</td> <td>Sartorius BIA Separações</td><td>110.5118-2, 2 &micro; m canais</td><td></td></tr><tr><td>CTP Solução</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R3331T2</tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na2 x 2H2O</td><td>Kemika&nbsp;</td><td>por exemplo, 11368 08</td><td></td></tr><tr><td>Solução GTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R2331T2</tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>1.10110.1000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC frasco de alta recuperação</td><td>Macherey-Nagel</td><td>702860</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM 9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microvolume espectrofotômetro</td><td>Thermo Scientic</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>padrão de mRNA, mFix4, 4000 nt</td><td>Sartorius BIA Separações</td><td>BIA-mFix4.1.1</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7 + 10 H2O</td><td>Sigma</td><td>S6422-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fluka</td><td>31434-1KG-M</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>1064691000</td><td></td></tr><tr><td>PATfix mRNA plataforma analítica&nbsp;</td>Pipeta <td>de PAT0021 de</td><td></td> <td>Separações BIA Sartorius</td></tr><tr><td>100 &ndash; 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 2 - 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Reference 2</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 20 &ndash; 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>Referência 2</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfatase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>M2403L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase Away Reagente de Descontaminação</td><td>Termocientífico</td><td>10328011</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNAse</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>RNK3501</tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>85558-5G</td><td></td></tr><tr><td>T7 mRNA polimerase</td><td>MEBEP BIOSCIENCE</td><td>TR01</td><td></td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Thermo Scientic</td><td>EPPE5382000.015</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T6066-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Solução UTP</td><td>MEBEP BIOSCIENCE&nbsp;</td><td></td><td></td>R5331T2</tr><tr><td>Tampas de frasco</td><td>Macherey-Nagel</td><td>70245</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>V1900</td><td></td></tr></tbody></table>

otimização da reação de transcrição in vitro para produção de mrna usando monitoramento cromatográfico em linha

Optimization of In vitro Transcription Reaction for mRNA Production Using Chromatographic At-Line Monitoring

A análise cromatográfica descrita neste protocolo pode ser usada para otimização de IVT ou para converter uma reação de IVT em lote em uma reação de batelada alimentada (Figura 1).
Para testar o efeito de diferentes composições de tampão na cinética da reação IVT, três reações diferentes de IVT foram misturadas de acordo com o protocolo escrito na Tabela 2. O tampão contendo Tris, onde o pH foi ajustado com HCl, foi comparado ao tampão Tris, onde o pH foi ajustado com ácido acético. Além disso, ambos os tampões Tris foram comparados com o tampão HEPES, onde o pH foi ajustado com NaOH. A composição de todo o tampão 1x IVT foi de 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM de espermidina e pH 7,9.
A partir de 100 μL de mistura de reações IVT, 2 μL de amostra IVT foram retirados da reação IVT e temperados com 2 μL de EDTA 100 mM a cada 15 min na primeira hora de incubação e depois a cada 30 min até 180 min de incubação. O rendimento final esperado de mRNA para esta condição de reação foi de 15 mg / mL, o que significa que a diluição de 2 vezes devido à têmpera foi seguida por uma diluição de 400 vezes em MPA + NaCl para análise. A amostra foi diluída 800 vezes no total, o que significa que, mesmo com produção de 15 mg/mL, a concentração de mRNA carregada na coluna cromatográfica analítica ainda estava dentro das concentrações da curva de calibração.
As áreas de NTP e mRNA em A260 foram integradas para cada amostra individual em cada ponto de tempo individual (tx). As áreas foram então convertidas em concentrações para mRNA, usando a curva de calibração de mRNA e porcentagem de consumo para NTPs, usando a área A260 de NTPs em 0 min (t0) como 100% (veja a equação abaixo).
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67503/67503eq01.jpg" style="margin: auto;">
Os resultados podem ser mostrados como gráficos para cada reação IVT individual, onde o tempo é mostrado no eixo x e a concentração de mRNA e os NTPs restantes são mostrados no eixo y (Figura 2A). Todos os IVT, ou seja, as concentrações de mRNA na dependência do tempo, também podem ser plotados juntos em um gráfico, e a cinética de produção de mRNA pode ser estudada e as condições ideais de IVT selecionadas (Figura 2B).
Para o experimento do lote alimentado, o IVT foi misto conforme escrito na Tabela 3. De 300 μL de mistura de reação IVT, 2 μL de amostra IVT foram removidos da reação IVT e temperados com 2 μL de EDTA 100 mM a cada 30 min. Além disso, a amostra foi coletada imediatamente após cada adição de NTP + MgCl2 a granel. Uma solução de alimentação contendo 42,4 mM de cada NTP e 152,5 mM de MgCl2 foi preparada com antecedência, e 106 μL de cada NTP individual de 200 mM foram misturados com 76,2 μL de 1 M MgCl2. Um regime alimentar foi estabelecido, onde a alimentação em bolo foi adicionada a cada hora (aos 60 min, 120 min, 180 min e 240 min de incubação). O regime de alimentação é descrito na Tabela 3 As amostras foram analisadas quase em tempo real com análises conforme descrito para a reação IVT em massa. Após 300 minutos de monitoramento, a reação de IVT foi extinta.
Os resultados podem ser mostrados como produção restante de NTPs/mRNA ao longo do tempo de incubação. Como as adições de ração em bolus também diluem a reação de IVT, a concentração de mRNA na IVT cai a cada adição de ração ( Figura 3A ). O aumento na massa de mRNA também pode ser medido e apresentado por fatores de transcrição (definidos como mmRNA / mpDNA), mostrando aumento linear na produção de mRNA ao longo do tempo ( Figura 3B ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig01.jpg"> 
Figura 1: Visão geral esquemática (A) Representação do fluxo de trabalho de otimização de IVT com quantificação de análise cromatográfica em linha de NTPs e mRNA. B) Cromatogramas representativos de uma reação IVT descontínua, amostrados a (i) t0, (ii) ponto médio, (iii) pontos finais da reação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig02.jpg"> 
Figura 2: Gráficos de IVT em lote. (A) Gráfico representativo da reação IVT com produção de mRNA e consumo de NTP no eixo y. Platô de concentração de mRNA visível em 120 - 180 min de incubação que se correlaciona com o consumo de NTP como NTP limitante (ATP) é consumido em 120 min. (B) Gráfico IVT mostrando a influência do tampão IVT na cinética IVT. O IVT contendo o tampão A (Tris + ácido acético) mostrou a produção de mRNA mais rápida, seguido pelo tampão B (Tris + HCl) e o tampão C (HEPES + NaOH) como os mais lentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67503/67503fig03.jpg"> 
Figura 3: Gráfico IVT do lote federal. (A) Gráfico IVT onde alimentações NTP + MgCl2 foram adicionadas em 60, 120, 180 e 240 min. A concentração de mRNA na reação IVT cai a cada adição de ração devido à diluição com ração NTP + MgCl2 . (B) O aumento da massa de mRNA mostrado pelo fator de transcrição é linear durante toda a incubação da reação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/67503fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Protocolo genérico de IVT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 2: Protocolo de IVT em lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Tabela 3: Protocolo IVT em lote federal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67503/Table%203_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Otimização da reação de transcrição in vitro para produção de mRNA usando monitoramento cromatográfico em linha

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