Name: Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Aprenda a identificar genes críticos para proliferação anormal de células-tronco hematopoiéticas combinando CRISPR/Cas9 com ensaio CCK-8. Este método revela alvos terapêuticos potenciais para leucemia.

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<ol><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
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<li>Chopra, M., Bohlander, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+of+origin+and+the+leukemia+stem+cell+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).</li>
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<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+and+transcriptional+activation+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.</a> Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).</li>
<li>Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice.</a> Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).</li>
<li>Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+intracellular+immunity+to+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus.</a> Cell. 62 (1), 51-61 (1990).</li>
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<li>Pinello, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+CRISPR+genome-editing+experiments+with+CRISPResso%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso.</a> Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).</li>
<li>Cai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+long+noncoding+RNA+CRISPRi+screen+identifies+PRANCR+as+a+novel+regulator+of+epidermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis.</a> Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).</li>
<li>Ng, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modeling+and+functional+validation+of+candidate+tumor+suppressor+genes+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).</li>
<li>Crowther, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR-Cas9+screening+reveals+ubiquitous+T+cell+cancer+targeting+via+the+monomorphic+MHC+class+i-related+protein+MR1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1.</a> Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+genomic+loci+with+dCas9+and+engineered+sgRNAs+using+CRISPRainbow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).</li>
<li>Szlachta, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockout+screening+identifies+combinatorial+drug+targets+in+pancreatic+cancer+and+models+cellular+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response.</a> Nat Commun. 9 (1), 4275(2018).</li>
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<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Heckl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+mouse+models+of+myeloid+malignancy+with+combinatorial+genetic+lesions+using+CRISPR-Cas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing.</a> Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m membrana de microfiltração</td><td>Sartoriu</td><td>16533K-1</td><td></td></tr><tr><td>tubo EP de 1,5 mL</td><td>LABLEAD</td><td>MCT-150-CLD-1</td><td></td></tr><tr><td>prato de 10 cm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>tubo de 15 mL</td><td>Seringa</td> estéril <td>LABLEAD LXG1500</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringa</td><td></td><td></td><td></td>estéril</tr><tr><td>2x Accurate Taq Master Mix (corante mais)</td> <td>Accurate Biology</td><td>AG11010</td><td>Para PCR de colônia</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>LABLEAD</td><td>LXG5000</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluorouracil</td><td>Sigma</td><td>F6627-1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; peneira de célula m</td><td>Falcon&reg;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 poços</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>ACK Lysis Buffer</td><td>Leagene</td><td>CS0001</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BIODEE</td><td>DE0010</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td></td></tr><tr><td>Aplicada Biosystems Thermal Cyclers para PCR</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Bimake</td><td>B34304</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>eppendorf</td><td>Centrífuga 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean& Concentrador-5</td><td>ZYMO</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Sangue & Kit Tissure</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmbI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>ExCell</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 9.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>ATCC; Virgínia, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>KOD-Plus-Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td></td></tr><tr><td>lentiGuide-Puro</td><td>Addgene</td><td>52963</td><td>vetor de espinha dorsal</td></tr><tr><td>LSL-Cas9</td><td>camundongos Modelo Animal Centro de Pesquisa da NANJING UNIVERSITY&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>espectrofotômetro de absorbância de microplacas</td> T002249 <td>BIO-RAD</td><td>xMark&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Rhawn</td><td>R019772</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Proteintech</td><td>B600070</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100x</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G plasmídeo</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Beyotime</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sódio ácido poliinosínico-policitidílico</td><td>Sigma</td><td>P1530</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>RecombinanteMurineIL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13-10ug</td><td></td></tr><tr><td>RecombinanteMurineIL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16-2ug</td><td></td></tr><tr><td>RecombinanteMurineSCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Agarose regular</td><td>BIOWEST</td><td>BY-R0100</td><td></td></tr><tr><td>Camarão Fosfatase Alcalina (rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Ultra-Micro SpectraMax QuickDrop</td><td>VÍCIOS MOLECULARES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 Células competentes</td><td>BioMed</td><td>BC108-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinucleotídeo Quinase</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4-Ligase</td><td>Takara</td><td>2011B</td><td></td></tr><tr><td>TIANprep Rapid Mini Plasmid Kit TIANGEN</td><td></td><td>DP105-03</td><td></td></tr><tr><td>Solução azul de trippano</td><td>LABLEAD</td><td>C0040-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>WEHI-CM</td><td>Nanjing Fuksai Biotechnology&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CBP50079 EXTRATO DE LEVEDURA</td><td>OXÓIDE</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia crispr/cas9 com contagem de células

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Efeito do nocaute de Trp53 na capacidade proliferativa de HSPCs de camundongos Aqui, usamos o nocaute Trp53 como exemplo para demonstrar esse protocolo. Para investigar o efeito do nocaute de Trp53 na capacidade proliferativa de HSPCs de camundongos, empregamos transfecção lentiviral para introduzir o sgRNA de Trp53 em células da medula óssea que expressam Cas9 enriquecidas para HSPCs após o tratamento com 5-FU. Simultaneamente, sg...

Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

evaluation-abnormal-growth-related-genes-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Gene alvo edição usando CRISPR/Cas9 facilitou muito a compreensão das funções biológicas dos genes. Aqui, nós utilizamos a metodologia CRISPR/Cas9 a mutações de calreticulin modelo em células hematopoiéticas dependentes de citocina para estudar sua atividade oncogênica.

Usando CRISPR/Cas9 Gene edição para investigar a atividade oncogênica do mutante Calreticulin em células hematopoiéticas dependentes de Cytokine

Um protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediada disrupção do gene no mouse e células hematopoiéticas primárias humanas é descrito neste artigo. Ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA são introduzidas através de eletroporação com sgRNAs gerados através da transcrição em vitro e Cas9 comercial. Alta eficiência de edição é obtida com tempo limitado e custo financeiro.

Disrupção do Gene altamente eficiente de células progenitoras hematopoiéticas murino e humano por CRISPR/Cas9

Este manuscrito descreve um método de CRISPR-Cas9-baseado em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) para investigação célere e simples do papel dos vários genes candidatos na proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) em paralelo. Esta técnica é escalável e pode ser aplicada em outras linhas de células de câncer também.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Uma biblioteca CRISPR/sgRNA aplicou-se para interrogar os genes codificantes de proteínas. No entanto, a viabilidade de uma biblioteca de sgRNA para descobrir a função de um limite CTCF na regulação gênica permanece inexplorada. Aqui, descrevemos uma biblioteca de sgRNA específico de loci HOX para elucidar a função dos limites CTCF HOX loci.

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA biblioteca rastreio identificando crítico CTCF limites

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

A entrega direta de complexos de ribonucleoproteína de RNA de Cas9/guia pré-montados é um meio rápido e eficiente para a edição de genoma em células hematopoiéticas. Aqui, nós utilizamos esta aproximação para suprimir de um silenciador intronic RUNX1 e para examinar as respostas transcricional em pilhas leucêmicas OCI-AML3.

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

O presente protocolo descreve um procedimento de cultura otimizado de células-tronco hematopoiéticas e células progenitoras (HSPC) para o enxerto robusto de células editadas por genes in vivo.

Edição de Genes CRISPR/Cas9 de Células-Tronco Hematopoiéticas e Progenitoras para Aplicações de Terapia Gênica

Novas estratégias para modelar fielmente mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) são necessárias para melhor estudar a biologia das células-tronco hematopoiéticas e as neoplasias hematológicas. Aqui, um protocolo para modelar mutações heterozigotas de ganho de função em HSPCs combinando o uso de CRISPR/Cas9 e transdução dupla de doador de rAAV é descrito.

Engenharia de Mutações de Ganho de Função Heterozigotas Oncogênicas em Células-Tronco Hematopoiéticas Humanas e Progenitoras

O método apresentado descreve a geração de um nocaute gênico mediado por CRISPR na linhagem H9 de células-tronco embrionárias humanas (hESC), que expressa de forma estável sgRNAs direcionados ao gene L2HGDH usando um sistema de entrega de genes mediado por lentivírus altamente eficiente.

Deleção gênica mediada por CRISPR-Cas9 em células-tronco pluripotentes humanas cultivadas em condições livres de alimentador

Desenvolvemos um protocolo otimizado de triagem knockout CRISPR-Cas9 para células CAR T primárias. Ao reduzir a transferência de gDNA por meio da digestão enzimática e da redução do de sgRNA, essa abordagem minimiza artefatos de PCR, garantindo a detecção precisa de sgRNA e a identificação robusta de alvos genéticos funcionais.

Melhorando as telas CRISPR-Cas9 em células CAR T: Um método refinado para preparação de bibliotecas

Aprenda a identificar genes críticos para proliferação anormal de células-tronco hematopoiéticas combinando CRISPR/Cas9 com ensaio CCK-8. Este método revela alvos terapêuticos potenciais para leucemia.

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