Avaliação de genes anormais relacionados ao crescimento de células-tronco hematopoiéticas e progenitoras combinando a tecnologia CRISPR/Cas9 com contagem de células

O escopo da pesquisa é a patogênese da leucemia. Nosso objetivo é identificar genes críticos para a proliferação anormal de HSPC combinando com ensaios CRISPR/Cas9 com CCK-8, revelando seus papéis na tumorogênese e o potencial como alvos de drogas.

A edição de genes baseada em CRISPR/Cas-9 fornece uma abordagem simples e eficiente para alcançar o nocaute genético em suas células eucarióticas. O desafio experimental atual é aumentar ainda mais a eficiência do nocaute CRISPR/Cas-9.

Nosso protocolo usa camundongos Cas-9 para fornecer às células da medula óssea a expressão consultiva de Cas-9, assim, a entrega viral de SGIs nas células, melhorando muito a eficiência experimental.

[Apresentador] Para começar, obtenha o fêmur e a tíbia do camundongo experimental sacrificado. Transfira o fêmur e a tíbia para uma capela de fluxo laminar imediatamente após a remoção para manter a esterilidade. Usando uma seringa estéril de um mililitro, lave a cavidade da medula óssea com PBS contendo 2% de FBS para coletar as células da medula óssea. Pipete as células da medula óssea para cima e para baixo 30 a 50 vezes para dispersá-las em células individuais. Transfira a mistura de células para um tubo de 50 mililitros e vórtice para misturar bem. Adicione 10 microlitros da suspensão celular a 40 microlitros de tampão de lise eritrocitária e coloque-o no gelo por cinco minutos para lisar os eritrócitos. Em seguida, adicione 50 microlitros de solução de azul de tripano. Misture bem e conte as células viáveis. Em seguida, centrifugue as células a 800 G por 15 minutos a quatro graus Celsius e aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda as células a uma concentração de uma a duas vezes 10 elevado a seis células por mililitro na medula óssea, meio de pré-estimulação. E semeie 10 mililitros da suspensão em um prato de 10 centímetros. Incube o prato por 24 horas a 37 graus Celsius. Para coletar as células pré-estimuladas no dia seguinte, adicione cinco a 10 mililitros de PBS contendo 2% de FBS e enxágue vigorosamente a placa. Transfira as células para um novo tubo e adicione azul de tripano às células. Conte as células viáveis na mistura. Em seguida, centrifugue as células a 800 G por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda as células em solução de spinfection recém-preparada a uma concentração de aproximadamente 10 elevado a seis células por mililitro. Semeie quatro mililitros da suspensão em cada poço de uma placa de seis poços. Sele a placa com parafilme e centrifugue-a a 1.500 G por 90 minutos a 32 graus Celsius. Após a centrifugação, ressuspenda suavemente as células com uma pipeta sem alterar o meio. Incube a placa por quatro a seis horas. Para a primeira transfecção, aspire aproximadamente três mililitros de meio sobrenadante de cada poço em um tubo e adicione um volume igual de meio de pré-estimulação da medula óssea. Se as células forem aspiradas acidentalmente, repita as etapas de centrifugação e ressuspensão conforme descrito anteriormente. Para a transfecção secundária, no dia seguinte, remova dois a três mililitros de meio de cada poço e adicione um volume igual de solução estoque retroviral recém-descongelada junto com quantidades apropriadas de hepas e poliverde. Centrifugue a placa a 1.500 G por 90 minutos a 37 graus Celsius. Após a centrifugação, ressuspenda suavemente as células e continue incubando por quatro a seis horas. Agora, substitua o meio conforme descrito anteriormente e incube por 24 horas. Lave a placa com PBS contendo 2% de FBS e colete as células. Filtre as células através de uma peneira de 70 micrômetros antes de contar as células viáveis usando azul de tripano. Em seguida, centrifugue as células a 800 G por 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células em DMEM contendo 10% de FBS e interleucina-3 murina, interleucina-6 e fator de células-tronco. Centrifugue cerca de 0,5 a 1x10 à potência de seis células a 800 G durante cinco minutos e elimine o sobrenadante. Armazene o pellet celular a -80 graus Celsius para extração de DNA genômico. Agora, adicione 1x10 à potência de quatro células por poço em uma placa de 96 poços, perfazendo seis poços replicados por grupo. Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS estéril aos poços circundantes e incube até diferentes pontos de tempo de 0, 24, 48 e 72 horas. Aspire o meio em cada ponto de tempo e adicione 110 microlitros de meio contendo 1/10 do volume de solução de CCK-8 aos poços. Incube a mistura por uma hora. Finalmente, medir a absorbância a 450 nanômetros usando um espectrofotômetro de microplacas. O nocaute de Trp53 aumentou significativamente a capacidade proliferativa de células-tronco de camundongo, hematopoiéticas e progenitoras em comparação com os controles em 24, 48 e 72 horas, conforme medido pelo ensaio CCK-8. A eficiência de edição do Trp53 foi estimada em 7,3% usando a análise TIDE. E o sequenciamento de próxima geração revelou mutações ocorrendo em diferentes posições no gene.