Técnicas de Patch-Clamp para Análise de Vesícula Endolisossômica Única

Os compartimentos endolisossômicos são as menores organelas das células. As técnicas eletrofisiológicas tradicionais são incapazes de medir diretamente suas mudanças de tensão e corrente. A técnica de patch-clamp do endolisossomo permite gravações diretas, permitindo-nos estudar previamente nos canais iônicos.

O principal desafio experimental é que nem todos os compostos aumentam efetivamente os lisossomos. Identificar células adequadas é difícil e, mesmo com lisossomos ideais, o registro bem-sucedido do canal iônico não é garantido. Desenvolvemos a técnica de endolisossomo-patch clamp para permitir registros eletrofisiológicos diretos das membranas endolisossômicas.

Essa descoberta nos permitiu caracterizar canais iônicos, como TRPMLs e TPCs, revelando seus papéis na defesa de patógenos, degeneração de neurônios e distúrbios metabólicos. Nosso método permite gravações diretas de canais iônicos lisossômicos, superando as limitações de tamanho do patch-clamp de células inteiras e melhorando a seleção de vesículas enquanto integra técnicas baseadas em fluorescência. Para começar, instale o tubo capilar no polar.

Pressione o botão verde no teclado. Afrouxe o clampbotão e remova as pipetas puxadas do polar. Em seguida, coloque as pipetas puxadas no suporte Microforge.

Inspecione as pontas da pipeta usando uma lente objetiva de 35x, combinada com uma ocular de 15x para uma ampliação total de 525x. Use o micro manipulador para aproximar as pipetas de remendo do filamento. Ajuste o botão de temperatura para 80.

Assim que o aquecedor estiver ligado, pressione e segure o pedal por um a dois segundos para aplicar um breve pulso de calor. Após o polimento, coloque as pipetas polidas em uma caixa selada para evitar a contaminação por poeira. Adicione um mililitro da solução de banho à câmara.

Remova uma lamínula com células HEK 293 tratadas da placa de 24 poços. Transfira a lamínula para a câmara do microscópio. Use uma agulha de enchimento de plástico caseira para encher a pipeta de isolamento com solução de pipeta.

Instale a pipeta cheia na extremidade frontal do patch-clamp configuração. Sob um microscópio com objetiva de 40x e ocular de 10x, mova a pipeta de isolamento para perto de endossomos ou lisossomos suficientemente aumentados. Abaixe a pipeta de isolamento usando o micromanipulador até que ela toque a borda da membrana plasmática.

Mova rapidamente a pipeta para arrancar um pequeno pedaço da membrana. Usando a mesma pipeta, pressione a célula do lado oposto para espremer os endossomos / lisossomos a aproximadamente dois micrômetros da célula. Encha uma pipeta recém-polida com a solução de pipeta apropriada.

Instale a pipeta na extremidade frontal do amplificador. Aplique uma pressão positiva de 20 a 50 milibar na pipeta e mantenha-a travando a válvula. Em seguida, mova a ponta da pipeta para a solução do banho e posicione-a no centro do campo de visão.

Aplique pulsos de corrente repetidos para determinar a resistência da pipeta, a resistência da vedação e a resistência em série. Monitore o tamanho da ponta da pipeta, a formação do selo e o estabelecimento de toda a configuração endolisossômica. Mova rapidamente a pipeta para perto do topo da vesícula alvo.

Observe a vesícula se movendo ou rolando devido ao fluxo de fluido da pipeta. Ajuste a tensão de deslocamento da pipeta para zero milivolts. Libere imediatamente a pressão positiva para puxar a vesícula em direção à pipeta, formando um gigaseal em um segundo.

Para registro de vesículas inteiras, use um pulso curto de alta tensão de dois a cinco milissegundos para romper a membrana no ponto de contato entre a pipeta e a organela. Defina a tensão de 500 a 1000 milivolts. Para registrar a corrente, conduza experimentos de pinça de tensão endolisossomal usando uma ampla gama de tensões de entrada para avaliar as propriedades da membrana.

Durante a formação do gigaseal, a resposta atual diminuiu rapidamente, indicando o estabelecimento bem-sucedido do modo de ligação ao lisossomo. A aplicação repetida de correntes contínuas registradas de tensão de entrada através da membrana endolisossômica, mostrando correntes basais, ativadas por agonistas e de fuga.