Name: Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a usar um dispositivo de alongamento equibiaxial para estudar respostas mecânicas celulares em tempo real com microscopia confocal de alta resolução. Este método avança a pesquisa em mecanobiologia.

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<ol><li>Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stretching+device+for+high-resolution+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A stretching device for high-resolution live-cell imaging.</a> Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).</li>
<li>Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shearing-stretching+device+that+can+apply+physiological+fluid+shear+stress+and+cyclic+stretch+concurrently+to+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells.</a> J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).</li>
<li>Constantinou, I., Bastounis, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-stretching+devices%3A+advances+and+challenges+in+biomedical+research+and+live-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging.</a> Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).</li>
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<li>Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+effects+of+Rho+and+mechanical+stretch+on+stress+fiber+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).</li>
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<li>Wipff, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+covalent+attachment+of+adhesion+molecules+to+silicone+membranes+for+cell+stretching+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications.</a> Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).</li>
<li>Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrins+and+focal+adhesion+kinase+in+the+orientation+of+dermal+fibroblasts+exposed+to+cyclic+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Wound+J%22%5BJournal%5D)">Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain.</a> Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).</li>
<li>Chu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stretch+induces+hair+regeneration+through+the+alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages.</a> Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).</li>
<li>Le Roux, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanochemical+feedback+between+curved+membranes+and+BAR+protein+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization.</a> Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).</li>
<li>Kosmalska, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+of+membrane+remodelling+during+cell+mechanoadaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation.</a> Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).</li>
<li>Quiroga, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanosensing+mechanism+controls+plasma+membrane+shape+homeostasis+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale.</a> Elife. 12, e72316(2023).</li>
<li>Casares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydraulic+fracture+during+epithelial+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydraulic fracture during epithelial stretching.</a> Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).</li>
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<li>Kechagia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laminin-keratin+link+shields+the+nucleus+from+mechanical+deformation+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling.</a> Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).</li>
<li>Andreu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+force+loading+rate+drives+cell+mechanosensing+through+both+reinforcement+and+cytoskeletal+softening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening.</a> Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).</li>
<li>Phuyal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+stimulates+COPII+-dependent+secretory+trafficking+via+Rac1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1.</a> EMBO J. 41 (18), e110596(2022).</li>
<li>Oria, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+loading+explains+spatial+sensing+of+ligands+by+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force loading explains spatial sensing of ligands by cells.</a> Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).</li>
<li>Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+and+interpreting+point+spread+functions+to+determine+confocal+microscope+resolution+and+ensure+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).</li>
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<li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7 (12), 53004(2012).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Kopek, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+protocols+for+correlative+super-resolution+fluorescence+imaging+and+electron+microscopy+of+chemically+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples.</a> Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).</li>
<li>Balachandran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+induces+dual-mode+endothelial+to+mesenchymal+transformation+of+the+cardiac+valve%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).</li>
<li>Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+stretching+devices+as+research+tools%3A+Engineering+and+biological+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations.</a> Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).</li>
<li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elasticity+of+the+lung+extracellular+microenvironment+is+regulated+by+macroscale+tissue+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain.</a> Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Máscara de acetato</td><td>JD Fotodados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Biorad</td><td>161-0140</td><td>Solução de acrilamida a 40%</td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Resposta 3678</td><td>Persulfato de amônio para eletroforese, &ge; 98%</td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>281778</td><td>(3-aminopropil)trietoxissilano</td></tr><tr><td>Bomba microfluídica autônoma</td><td>Cobalto Elveflow</td><td>Cobalto Duplo</td><td>Cobalto Duplo</td></tr><tr><td>Bisacrilamida</td><td>Biorad</td><td>161-0142</td><td>Solução 2% Bis</td></tr><tr><td>Lâmina</td><td>Fisher Científico</td><td>11733919</td><td>Grupo Didático Hoja fez ctica X100 LAME BISTOURI ESTÉRIL N&deg; 23&nbsp; LAMD23&nbsp;</td></tr><tr><td>Clipes</td><td>Sprintis</td><td>AKXX000001</td><td>Bull Dog Clips, 32 mm, feito de metal, capacidade 10 mm, niquelado</td></tr><tr><td>Tratamento corona</td><td>Produtos eletrotécnicos</td><td>BD-20AC, SKU:12051A</td><td>TRATADOR CORONA DE LABORATÓRIO BD-20AC</td></tr><tr><td>Copos</td><td>VWR</td><td>611-1368</td><td>VWR, copos de copo, descartáveis, 250 mL</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>Coloração DAPI</td></tr><tr><td>Etanol 96%</td><td>Panreac Qu&iacute; mica, SLU</td><td>131085-1212</td><td>Etanol 96% v/v para an&aacute; lisis, ACS- 2,5 L</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td>Fibronectina, de plasma humano, líquido&nbsp; 0.1%</td></tr><tr><td>Microesferas Modificadas com Carboxilato FluoSpheres, 0.1 &micro; m</td><td>Tecnologia da Vida</td><td>F8801, F8803</td><td>Grânulos fluorescentes amarelos, verdes e vermelhos para avaliação de resolução</td></tr><tr><td>Microesferas Modificadas com Carboxilato FluoSpheres, 0.2 &micro; m</td><td>Fisher Científico</td><td>F8809, F8810</td><td>Grânulos fluorescentes amarelos, verdes e vermelhos para calibração de tensão</td></tr><tr><td>Glutaraldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6403</td><td>Solução de glutaraldeído 50% em H2O</td></tr><tr><td>Interferômetro</td><td>Veeco&nbsp;</td><td>Wyko NT1100</td><td>Interferômetro para medir espessuras de membranas PDMS</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Panreac Qu&iacute; mica, SLU</td><td>131090-1212&nbsp;</td><td>2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para um &aacute; lisis, ACS, ISO</td></tr><tr><td>Laiton pesa</td><td></td><td></td><td>Feito sob medida</td></tr><tr><td>Lenços de papel sem fiapos</td><td>Berkshire</td><td>DURX670, DR670090920</td><td>Toalhetes não tecidos</td></tr><tr><td>Lubrificante (vaselina)</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td>Vaselina</td></tr><tr><td>Alinhador de máscara</td><td>S&uuml; ss MicroTec&nbsp;</td><td>MJB4&nbsp;</td><td>Alinhador de máscara para fotolitografia em placas de PMMA</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem - Merck</td><td>475904</td><td>Reagente MOWIOL 4-88</td></tr><tr><td>Disco giratório para microscópio NIKON confocal</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E/B</td><td>equipado com Nikon Ti-S-ER&nbsp; palco</td></tr><tr><td>Microscópio NIKON Vertical</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ni-E</td><td>equipado com estágio Nikon NI-SH-E</td></tr><tr><td>Objetivo 60x</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo NIR 60X W</td><td>NIR Apo 60X/1.0w DIC N2 WD 2.8</td></tr><tr><td>Solução PBS</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>DPBS, 10x</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>2401673921</td><td>Sylgard - 184 Kit de Elastômero de Silicone DN 109</td></tr><tr><td>Tampa do anel da placa de Petri (grande)</td><td>Proquinorte</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177925 diametro 100</td></tr><tr><td>Tampa do anel da placa de Petri (pequena)</td><td>Proquinorte</td><td>93060</td><td>Plato de cultivo celular TPP SKU: 07177924</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Harrick&nbsp;</td><td>PDC-002</td><td>Gerador de plasma de oxigênio</td></tr><tr><td>Placas e anéis de PMMA</td><td></td><td></td><td>Consulte a tabela de especificações do Excel em documentos suplementares</td></tr><tr><td>Prolongar</td><td>Invitrogen</td><td>Pág. 36930 / Pág. 36934</td><td>Reagente antidesbotamento ProLong Gold</td></tr><tr><td>Repelir-Silano</td><td>GE Saúde</td><td>17-1332-01</td><td>PlusOne Repelente-Silano ES</td></tr><tr><td>Anéis/anel de borracha</td><td>Tecnifil</td><td></td><td>Feito sob medida</td></tr><tr><td>Revestidor giratório</td><td>Loureiro</td><td>WS-650Sz</td><td>Revestidor giratório</td></tr><tr><td>SPY650-DNA</td><td>Espirocromo</td><td>SC 501</td><td>SPY650-DNA</td></tr><tr><td>Colher de direção</td><td>VWR</td><td>231-0416</td><td>Espátula descartável curta Eco, colher e colher duplas, aditivo PP e EcoPure</td></tr><tr><td>Resina SU8 2100</td><td>Microquímica</td><td>Y111075</td><td>SU8-2100</td></tr><tr><td>SU8-Desenvolvedor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Acetato de éter monometílico de propilenoglicol</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-50ML</td><td>N, N, N ', N'-Tetrametiletilenodiamina, biorreagente adequado. Reagente para eletroforese</td></tr><tr><td>Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>448931</td><td>&nbsp; Tricloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctil) silano</td></tr><tr><td>Pinças</td><td>IESMAT</td><td>T5039&nbsp;</td><td>Pinça Dumont HP 7 Aço Inoxidável. Ponta de 0,17 x 0,10 mm. (Ágar Científica Ltda)</td></tr><tr><td>Controlador de vácuo</td><td>GARCAP / Parker</td><td>&nbsp; 990-005203-005&nbsp;</td><td>Controlador de vácuo&nbsp;</td></tr><tr><td>Controlador de vácuo fluigente</td><td>Fluigente</td><td>LU-FEZ-N800</td><td>Fluxo de linha EZ (n800mbar)</td></tr><tr><td>Papel de bancada branco</td><td>Raima</td><td>931.1001</td><td>&nbsp; Papel Raima 42 x 52</td></tr></tbody></table>

dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

Equibiaxial Stretching Device for High Magnification Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy

Calibração e radialidade A caracterização adequada da cepa obtida é uma garantia de reprodutibilidade e controle dos experimentos. Embora esferas fluorescentes possam ser adicionadas a cada amostra para registrar com precisão a tensão, uma etapa de calibração anterior garante o planejamento adequado para o experimento, sabendo a magnitude da tensão que o experimentalista deseja aplicar à amostra antes do alongamento real. A deformação não dependerá apenas do vácuo aplicado, mas variará dependendo das ...

Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

Cells are continuously exposed to mechanical forces in physiological and pathological situations, including a variety of tensile and compressive stresses. ...

equibiaxial-stretching-device-for-high-magnification-live-cell

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Xenopus embrionárias epitélios são um sistema modelo ideal para estudar os comportamentos das células, como o desenvolvimento de polaridade e mudar de forma durante a morfogênese epitelial. Histologia tradicional de amostras fixa é cada vez mais sendo complementado por live-célula de imagem confocal. Aqui nós demonstrar os métodos para isolar os tecidos de rã e visualizar ao vivo as células epiteliais e seus citoesqueleto usando live-célula microscopia confocal.

Em células vivas, Imagem e Análise Quantitativa de células embrionárias epiteliais em Xenopus laevis</em

Ilustramos o uso de uma constante de força axial pinças ópticas para explorar as propriedades mecânicas das moléculas de ADN curtas. Esticando DNA axialmente, minimizamos impedimento estérico e artefatos provenientes de manipulação laterais convencional, o que nos permite estudar moléculas de DNA tão curto quanto ~ 100 nm.

Alongamento curtas seqüências de DNA com Pinça força constante óptico axial

Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.

Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology

Um novo protocolo de imagem foi desenvolvido usando um atuador mecânico acionado por motor personalizado para permitir a medição de respostas em tempo real à tensão mecânica em células vivas. Relevante para a mecanobiologia, o sistema pode aplicar deformações de até 20%, permitindo imagens quase em tempo real com microscopia de força confocal ou atômica.

Imagens de células vivas durante Mecânica estiramento

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Usando um dispositivo projetado previamente para aplicar a tensão mecânica às pilhas aderentes, este papel descreve uma geometria redesenhada do substrato e um instrumento personalizado para a imagem latente da único-pilha de alta resolução de pilhas tensas com um objetivo da imersão do óleo 100x.

Imagem latente de alta resolução da dinâmica nuclear em pilhas vivos a tensão elástica uniaxial

Apresentado aqui é o protocolo da técnica Conpokal, que combina microscopia de força confocal e atômica em uma única plataforma de instrumentos. Conpokal fornece a mesma célula, mesma região, imagens confocal simultâneas e caracterização mecânica de amostras biológicas vivas.

Microscopia confocal e força atômica (Conpokal) em células vivas

Apresentado aqui é um protocolo para imagens de células vivas de super-resolução em tecido intacto. Nós padronizamos as condições para a imagem de uma população de células-tronco adultas altamente sensíveis em seu ambiente de tecido nativo. Esta técnica envolve o equilíbrio da resolução temporal e espacial para permitir a observação direta de fenômenos biológicos no tecido vivo.

Imagem celular ao vivo super-resolução de estruturas subcelulares

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

A microscopia de super-resolução pode fornecer uma visão detalhada da organização dos componentes dentro do complexo sinaptonemal na meiose. Aqui, demonstramos um protocolo para resolver proteínas individuais do complexo sinaptonemal de Caenorhabditis elegans .

Microscopia de super-resolução do complexo sinaptonemal dentro da linha germinal de Caenorhabditis elegans

Aqui, apresentamos um dispositivo inovador que aplica formas de onda de deformação isotrópicas e uniaxiais às células, enquanto apoia o cultivo em substratos com rigidez sintonizável e matrizes proteicas personalizáveis. Essa plataforma simples e econômica permite que pesquisadores investiguem como pistas mecânicas regulam a função celular tanto em estudos fundamentais quanto em contextos relevantes para doenças.

Uma plataforma inovadora para alongamento celular in vitro e imagem

Aprenda a usar um dispositivo de alongamento equibiaxial para estudar respostas mecânicas celulares em tempo real com microscopia confocal de alta resolução. Este método avança a pesquisa em mecanobiologia.

Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

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