Dispositivo de alongamento equibiaxial para microscopia de fluorescência confocal de células vivas de alta ampliação

Estudamos como as células respondem e se adaptam a estímulos mecânicos em contexto fisiológico e patológico. Para isso, usamos o dispositivo de alongamento para aplicar forças externas, uma tensão neste caso, às células.

Descobrimos como as células e os tecidos celulares reagem a estímulos mecânicos específicos e como eles respondem mecanicamente a outras pistas biológicas.

Nosso dispositivo de alongamento é muito versátil em comparação com outros, pois oferece a possibilidade de esticar células cultivadas em géis de poliacrilamida de diferentes rigidezes ou realizar experimentos de compressão.

[Narrador] Para começar, coloque os anéis de PMMA em uma folha de papel de bancada branco. Passe cuidadosamente ao redor da borda da placa revestida com PDMS usando uma lâmina para garantir um corte limpo ao longo de toda a circunferência. Use uma pinça para levantar a membrana em uma borda e, em seguida, descasque-a suavemente com o polegar para separar uniformemente metade da membrana da placa. Use os dedos para espalhar etanol a 96% uniformemente em toda a superfície superior do anel de PMMA. Remova cuidadosamente a membrana PDMS da placa, levantando-a da borda levantada anteriormente. Em seguida, coloque-o simetricamente no anel de PMMA coberto de etanol, garantindo que não haja rugas e evitando o alongamento. Em seguida, pegue outro anel de PMMA vazio e coloque-o em cima do anel de montagem. Use clipes de metal para selá-los, imprensando a membrana PDMS entre os dois anéis. Posicione a metade inferior do anel elástico no suporte de montagem. Coloque o anel PDMS imprensado no anel elástico e empurre-o para baixo com firmeza até que esteja totalmente encaixado, garantindo que a junta esteja posicionada corretamente. Coloque os pesos circulares de latão em cima da amostra. Em seguida, coloque a metade superior do anel elástico de metal na parte superior, alinhando os orifícios dos parafusos. Insira todos os parafusos e aperte-os. Corte o PDMS ao redor do anel suavemente usando uma lâmina. Cubra o conjunto com uma placa de Petri para proteger a membrana da poeira. Prepare uma diluição de 250.000 esferas fluorescentes de 0,2 micrômetro em PBS usando diluição serial. E coloque uma gota de 10 a 30 microlitros da solução de esferas no centro do PDMS. Deixe secar a uma temperatura não superior a 40 graus Celsius para evitar problemas de confusão pós-cura. Agora, monte o dispositivo de alongamento no suporte do microscópio e prenda o poste de alongamento no microscópio. Aplique lubrificante generosamente na área circular do poste. Monte o anel elástico preparado no poste de alongamento e aparafuse a tampa superior para vedar o conjunto. Em seguida, conecte a parte traseira da caixa de controle de vácuo à fonte de vácuo, seguida pela frente da caixa ao poste de alongamento. Para realizar a calibração de deformação, escolha um campo de interesse que contenha uma alta densidade de cordões e aglomerados de cordões reconhecíveis para o usuário. Adquira uma imagem em repouso do campo de visão selecionado e salve a posição. Aplique alongamento em um nível de vácuo baixo de 20 milibar negativos, causando movimento em todas as direções. Agora, reoriente o foco no plano Z e mova o palco nas direções XY para localizar a mesma região de interesse e adquirir uma imagem no estado esticado. Em seguida, libere a cepa e repita as etapas com um nível de vácuo mais alto. Armazene as imagens adquiridas em uma pasta organizada por amostra. Nome, a imagem do cordão de referência adquirida sem alongamento como reference_str1 e as imagens esticadas em níveis crescentes de vácuo como stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3 e assim por diante. Para quantificar a cepa, abra o MATLAB e carregue o código da cepa de gel. Depois de definir os parâmetros, defina o pai, bem como os caminhos da pasta do experimento e execute o código. Em seguida, abra stretched_str1 conforme solicitado pelo código, seguido do reference_str1. Agora, calcule a matriz de deformação mediana para cada nível de vácuo. Depois de repetir esse processo para pelo menos três amostras, plote a matriz de deformação mediana versus o nível de vácuo para obter a curva de calibração. Para revestir o anel PDMS, esterilize-o sob luz ultravioleta por 15 minutos. Sob um gabinete de biossegurança, enxágue a placa sob o capô com PBS estéril. Após a aspiração, todo o PBS usado para enxaguar a placa. Deposite uma gota de 100 a 200 microlitros da solução no centro do anel. Desenhe o perímetro da gota com um marcador permanente na parte inferior da membrana PDMS e incuba-o. No dia do experimento, lave a proteína de adesão com PBS. Depois de tripsinizar as células, prossiga para a contagem de células. Semeie um número apropriado de células em um pequeno volume de cerca de 20 a 50 microlitros com meios celulares padrão para promover a fixação e incube-o em uma incubadora de dióxido de carbono com controle de umidade. Após 20 a 30 minutos, adicione suavemente 500 microlitros de meio em cima das células e retorne a placa à incubadora para permitir uma maior disseminação celular. Para um único ciclo de liberação de estiramento e imagem, monte o anel de estiramento na platina do microscópio, conforme demonstrado anteriormente. Depois de localizar uma célula de interesse, registre sua posição e capture uma imagem da célula pré-esticada. Aplique o nível de vácuo desejado correspondente à deformação do substrato necessária com base na curva de calibração para esticar a célula. Para localizar a célula de estiramento, primeiro refoque no plano Z. Em seguida, mova-se nas direções XY para centralizar a célula no campo de visão. Grave imagens durante a duração desejada. Navegue até a posição original da célula e ative o modo de aquisição do microscópio para garantir que a captura da imagem comece imediatamente após a refocagem. Solte o alongamento e refoque rapidamente manualmente no plano Z. Capture imagens da célula liberada pelo tempo necessário, ajustando manualmente o foco durante a aquisição. Para pós-processamento, abra Fiji e carregue as imagens adquiridas em repouso e durante a tensão. Use o modelo de plug-in Fiji correspondente para selecionar uma região da célula para alinhamento. A calibração garantiu a reprodutibilidade e o controle sobre a deformação aplicada, confirmando uma relação quase linear entre vácuo e deformação de até 20%. A análise do deslocamento radial demonstrou isotropia e homogeneidade da deformação sobre a membrana PDMS. A imagem de fluorescência de células de fibroblastos sob estiramento de células vivas revelou invaginações de membrana após a liberação do estiramento, que foram reabsorvidas em três a cinco minutos. O realongamento de células fixas permitiu a aquisição de imagens em um estado esticado, evitando artefatos de dobramento artificial. A membrana PDMS com uma grade padronizada facilitou a imagem multimodal, permitindo a localização das mesmas células em fluorescência e microscopia eletrônica de varredura. As células assentadas em géis moles de PAA revestidos com fibronectina formaram aderências focais apenas quando submetidas a ciclos de estiramento cíclico específicos em comparação com células não esticadas.