Mapeamento mecânico de esferoides usando espectroscopia de Brillouin

Estamos usando espectroscopia de Brillouin para avaliar a mecânica celular de forma não invasiva e entender o papel da mecanobiologia na progressão da doença. Tecnologias não invasivas, como a espectroscopia de Brillouin, nos permitem caracterizar a mecânica em três dimensões, mas sem perturbar a amostra. Para começar, pré-trate os poços da placa micropoço adicionando 500 microlitros de solução antiaderente de enxágue a cada poço.

Centrifuge a placa a 1.300 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Após eliminar as bolhas de ar, remova a solução antiaderente dos poços. Em seguida, adicione um mililitro de PBS a cada poço e aspire completamente.

Após repetir a lavagem PBS, determine o número de células por esferoide e o número de esferoides por gel de acordo com o desenho experimental. Faça pellets nas células e ressuspenda-as em um mililitro de DMEM suplementado. Depois, adicione um mililitro dessa suspensão de célula em um poço da placa do micropoço e misture bem.

Centrifuge a placa a 100 g por três minutos em temperatura ambiente. Observe a placa do micropoço ao microscópio para confirmar a distribuição uniforme das células e se elas se depositaram no fundo dos poços. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir a formação de esferoides.

Para colher os esferoides, remova suavemente e lentamente a mídia cultural sem perturbar os esferoides. Corte a ponta da pipeta revestida com PBS/FBS para alargar a abertura e adicione 500 microlitros de PBS a cada poço para desalojar os esferoides. Colete o PBS contendo os esferoides em um tubo.

Depois, transferir 50 microlitros da suspensão esferoide para um poço de uma placa de 96 poços. Para ajudar na contagem, desenhe uma cruz no fundo do poço usando um marcador permanente e conte o número de esferoides nesse volume ao microscópio. Use a equação para calcular o número total de esferoides.

Abra o software SpectraLok e espere até que todos os dispositivos conectados sejam detectados. Depois, selecione a câmera do espectrômetro. Instale o cubo de acrílico no suporte da amostra do microscópio com o lado transparente voltado para a lente objetiva.

Abaixe a lente objetiva o máximo possível e centralize o cubo embaixo dela. Certifique-se de que o caminho óptico no microscópio esteja configurado para que a câmera do espectrômetro seja exposta, girando o seletor de porta rotativa para L.In a janela da Câmera SpectraLok, ajuste o tempo de exposição do sensor para 500 milissegundos e o ganho de software para 100. Pressione Capturar e mova lentamente a lente do objetivo para cima.

Continue elevando a lente até que os picos de Brillouin fiquem visíveis e sua intensidade se estabilize, indicando que o ponto focal está posicionado dentro do cubo de acrílico. Agora, abra a janela de controle do Pump Killer, ou PK. Aproxime-se de um dos ordens Brillouin mais brilhantes e ajuste a posição do atuador de pressão em incrementos de 100 micrômetros clicando em mover rel para minimizar a intensidade máxima de Rayleigh.

Se o sinal de Rayleigh aumentar, clique em Reverter para alterar a direção de ajuste. Quando a intensidade máxima de Rayleigh diminui, ajuste a pressão do etalon em incrementos menores de 10 micrômetros. Na janela da Câmera, dê um zoom em uma das ordens Brillouin.

Pressione S para visualizar as faixas nas quais a LUT é aplicada à imagem da câmera. Abra a janela de Configurações e pressione Calibrar Rápido para recalcular automaticamente o deslocamento horizontal ideal das listras. Após verificar o alinhamento da faixa, ajuste os eixos da lente do colimador para maximizar a eficiência de acoplamento da luz do Pump Killer ao espectrômetro.

Depois, abra a janela do Spectrum e clique em Desdobrar para recuperar o Spectrum. Em um cubo acrílico homogêneo, busque supressão completa do sinal de Rayleigh e ajuste até que o sinal de Brillouin fique claramente visível. Para salvar os parâmetros otimizados, clique em Atualizar Todos e depois Salvar Todos na janela de controle PK.

Por fim, na janela principal, clique em Salvar na seção de I/O de Arquivo para armazenar a configuração. Após abrir o software de varredura, instale a placa de Petri com fundo de vidro contendo a amostra de esferoide de hidrogel no lugar do cubo de acrílico. Remova a tampa da placa de Petri, adicione substrato suficiente para submergir o gel e coloque uma capa de cobertura por cima para evitar o movimento do gel.

Localize o esferoide bloqueando primeiro o feixe de laser. Alterne o caminho óptico do microscópio para a ocular e ligue a iluminação de luz branca. Usando o joystick, controle manualmente o estágio de amostra para localizar e focar no esferoide.

Adquira uma imagem de campo claro do esferoide e ajuste o brilho da iluminação girando a roda de controle. Mude o caminho óptico para R para expor a câmera do microscópio e ajuste o tempo de exposição conforme necessário. Em seguida, ajuste a porta do microscópio para L e capture o fundo com o laser ainda bloqueado.

Desbloqueie o laser e, dependendo da relação sinal para ruído desejada, selecione um tempo de exposição entre 200 e 500 milissegundos. Do espectro não embrulhado, selecione a linha de ajuste Brillouin peak. Ajuste o valor do limiar para aproximadamente metade da intensidade do pico de Brillouin e exclua quaisquer picos de Brillouin com amplitude abaixo do limiar.

Aplique correção de comprimento de onda ao laser de acordo com todos os pares de picos de Brillouin identificados. Por fim, escolha a geometria da varredura raster ajustando a largura e o tamanho do passo, e inicie a varredura para registrar as medições. Imagens representativas de um esferoide de célula-tronco mesenquimatosa embutido no hidrogel mostraram mapas distintos de deslocamento de Brillouin e largura de linha de Brillouin, juntamente com imagens correspondentes de campo claro, núcleos e fluorescência de filamentos de actina.

O mapa de deslocamento de frequência Brillouin de baixa resolução foi segmentado em regiões de gel e esferoide com base no contorno traçado manualmente a partir da imagem do campo claro. Pixels ambíguos resultantes da redução de amostragem foram excluídos da análise, enquanto máscaras binárias claras para as regiões de gel e esferoide foram criadas para extrair valores BFS. A comparação de mapas BFS de alta e baixa resolução demonstrou que a amostragem de núcleo forneceu valores médios de BFS comparáveis a varreduras de alta resolução, indicando medição consistente da mecânica do volume esferoide.

Nosso protocolo fornecerá uma plataforma que permitirá aos pesquisadores estudar muitas doenças ligadas à mecanobiologia. Será interessante ver se mudanças no deslocamento de Brillouin que se correlacionam com propriedades mecânicas celulares são marcadores eficazes para os estágios da progressão da doença. Avaliaremos como os tratamentos farmacológicos influenciam a mecânica esferoide ao longo de escalas de tempo que imitam a progressão da doença.