Isolamento de células estromais mesenquimais derivadas do cordão umbilical alto BAMBI^humanoMFGE8^alto

Nosso escopo é isolar subgrupos específicos de UC-MSCs humanas e analisar suas características básicas de acordo com seus fatores transcriptômicos de célula única. Estamos tentando responder quais são os caracteres e funções distintos para diferentes subpopulações UC-MSC. Os desenvolvimentos mais recentes em nosso campo são a descoberta da heterogeneidade de populações mistas de MSC, principalmente usando sequenciamento de RNA de célula única.

Identificamos as três subpopulações dentro das UC-MSCs humanas, incluindo células altas de MFGE8 BAMBI. Este subgrupo exibe um fenótipo distinto, perfil transcriptômico único, potencial adipogênico limitado e atividade imunossupressora reduzida na nefrite lúpica. Essas descobertas avançam a compreensão das UC-MSCs e apoiam a seleção de subgrupos ideais para o tratamento de doenças específicas.

Estamos abrindo caminho para a compreensão das funções reais não apenas das CTMs de alta MFGE8 de BAMBI, mas também dos outros dois subgrupos, especialmente seus papéis no tratamento de diferentes doenças. Continuaremos a nos concentrar em iniciar aplicações de subgrupos UC-MSC humanos em múltiplas doenças imunomediadas e explorar seus mecanismos moleculares no tratamento dessas doenças. Para isolar BAMBI alto MFGE8 alto UC-MSCs, cultive UC-MSC a uma densidade de aproximadamente 5 a 10 vezes 10 elevado à potência de 6 células em DMEM completo.

Adicione EDTA 0,5 milimolar por cinco minutos para dissociar as células. Em seguida, adicione o DMEM completo e transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros. Pipete a suspensão celular para cima e para baixo várias vezes para preparar uma suspensão de célula única.

Tome 10 microlitros da suspensão celular. Conte as células usando um hemocitômetro e calcule o número total de células colhidas. Após a contagem, centrifugar o número necessário de células a 300 G durante cinco minutos.

Ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo para atingir uma concentração de 5 a 10 vezes 10 elevado a 6 células por mililitro e coloque o tubo no gelo. Em seguida, divida as células colhidas em quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione os anticorpos primários numa diluição de 1 a 100 aos tubos MFGE8 e BAMBI.

Misture bem o conteúdo e incube as células em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, adicione PBS para lavar as células marcadas. Centrifugar os tubos a 300 g durante cinco minutos e rejeitar o sobrenadante antes de ressuspender o sedimento num mililitro de meio completo.

Adicione os anticorpos secundários fluorescentes conjugados em uma diluição de 1 a 1.000 às células ressuspensas. Misture bem e incube os tubos em temperatura ambiente no escuro por quatro 15 minutos. Após a incubação, adicione PBS e centrifugue para lavar as células marcadas.

Ressuspenda o pellet em 500 microlitros de meio completo e filtre-os através de um filtro de células de 70 micrômetros para remover aglomerados e detritos. Transferir o filtrado para um tubo de 15 mililitros para a classificação por citometria de fluxo. Execute o tubo celular em branco como um controle negativo sem adicionar um anticorpo.

Ajuste as configurações de dispersão direta e lateral no citômetro de fluxo para estabelecer a escala de passagem para a população não corada. Em seguida, execute o MFGE8 e o BAMBI rotulados com anticorpos únicos como um controle de bloqueio para determinar onde a positividade começa no gráfico. Execute os tubos de amostra experimentais para classificar a população de células altas de MFEG8 BAMBI e coletar as células classificadas.

Coloque as MSCs classificadas em uma placa de 24 poços e incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Uma vez que as células classificadas tenham crescido através de duas passagens, realize a análise de citometria de fluxo para confirmar a pureza da população classificada. As UC-MSCs cultivadas foram fortemente positivas para a expressão de CD44, CD73, CD90 e CD105 e negativas para a expressão de CD14, CD34, CD45, CD79 e HLA DR.

As MSCs altas de BAMBI foram separadas de UC-MSCs humanas cultivadas, e seus níveis elevados de expressão de BAMBI e MFEG8 foram confirmados como persistindo por três a quatro passagens. A frequência de MSCs BAMBI high MFEG8 high variou de acordo com o doador e o método de dissociação.