Remoção Cirúrgica de um Órgão Sensorial Complexo em Ctenóforos Altamente Regenerativos

Nosso laboratório está interessado em entender as origens e a evolução das estratégias de história de vida animal. Significa reprodução, crescimento e desenvolvimento, incluindo regeneração. Os ctenóforos são excelentes modelos filogeneticamente informativos para esses fenômenos.

Ainda estamos aprendendo muito sobre a regeneração e a história de vida dos ctenóforos, embora as pessoas tenham estudado ambos por mais de cem anos. Um artigo do ano passado mostrou que quando dois ctenóforos são fundidos durante a regeneração, alguns de seus comportamentos se sincronizam. Mostrei que as mudanças dramáticas na forma do corpo que ocorrem à medida que nossas espécies de estudo crescem acontecem após o início da reprodução, o que é bem diferente de nossas idéias usuais sobre metamorfose.

Para começar, ajuste o bico de bunsen para produzir um cone azul afiado de chamas. Segure o centro de uma micropipeta capilar de vidro na chama até que amoleça sob uma leve pressão. Remova a pipeta da chama e separe imediatamente as duas extremidades para criar uma agulha curta e forte.

Alternativamente, agulhas de meia polegada de calibre 26 também podem ser usadas de forma eficaz, principalmente para a extremidade maior da faixa de tamanho focal. Para preparar pipetas de medição, corte pipetas de transferência de plástico usando uma tesoura afiada ou uma lâmina de barbear para formar aberturas com o diâmetro interno preferido. Prepare pelo menos uma pipeta para a parte superior e outra para a parte inferior da faixa de tamanho desejada.

Selecione animais que pareçam morfologicamente normais e tenham o tamanho e estágio desejados. Verifique se os animais não passam pela parte inferior da pipeta de calibragem, mas se encaixam confortavelmente na parte superior da pipeta de calibragem da gama. Use uma pipeta de transferência mais larga que o corpo do animal para movê-lo para um prato de poliestireno de 35 milímetros cheio de água do mar estéril.

Sob um microscópio de dissecação, role um animal de lado para acessar o órgão abdominal facilmente. Focalize o microscópio no órgão aboral. Usando a mão não dominante, segure suavemente o animal no lugar com uma agulha de vidro e com a mão dominante insira a ponta de uma agulha logo abaixo do órgão aboral.

Faça um corte oblíquo de uma borda até abaixo da base. Retire a agulha e faça um segundo corte para remover um pedaço em forma de cunha contendo as estruturas dos órgãos aborais, examine o tecido do animal e do excise para verificar a remoção bem-sucedida. Use a mesma pipeta de transferência para mover o animal dissecado para um novo prato cheio de água do mar estéril.

Em seguida, trate uma lâmina de microscópio padrão com um agente silanizante, como um tratamento de vidro repelente de água, e deixe-a secar completamente. Use uma pipeta de transferência para colocar um animal pós-cirúrgico na lâmina preparada e confirme se a água escorre com o animal dentro. Coloque aproximadamente 1,5 miligramas de massa de modelar em cada canto da lamínula para formar pés que servirão como espaçadores para levantar a lamínula do animal.

Coloque delicadamente a lamínula de cobertura, com a argila voltada para baixo, sobre o animal e enrole-a na posição. Pressione suavemente para comprimir levemente e segurar o animal no lugar. O ajuste é necessário para uma imagem ideal.

Para imagens por mais de 30 minutos, aplique uma fina camada de vaselina ao redor das bordas da lamínula para evitar que a amostra seque. O fechamento da ferida foi visivelmente concluído dentro de 20 minutos após a remoção do órgão aboral em mnemiopsis leidyi em estágio cipídeo com tecido abrangendo o local da ferida que estava inicialmente aberto e expondo o intestino. A regeneração progrediu gradualmente, com contração tecidual precoce evidente em 60 minutos após a cirurgia e regeneração completa do órgão abdominal observada em 72 horas.

No estágio lobular, o fechamento da ferida mnemiopsis leidyi em estágio lobular progrediu de forma constante e foi concluído 240 minutos após a cirurgia, com regeneração completa do órgão aboral, claramente visível em 120 horas.