Name: Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Aprenda a gerar células T CAR transientes usando mRNA não integrativo para imunoterapia contra câncer. Este método não viral oferece maior segurança e custo reduzido comparado à transdução viral tradicional.

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<table><tbody><tr><td>Corante de viabilidade 7-AAD&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>420404</td><td></td></tr><tr><td>ACEA Novocyte Citômetro de fluxo</td><td>Agilent</td><td>NovoCyte 3000</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V meio</td><td>Gibco</td><td>12055083</td><td></td></tr><tr><td>APC cabra anti-humano IgG F (ab ') 2 anticorpo</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>109-136-097</td><td></td></tr><tr><td>BglII Enzima de Restrição</td><td>New England BioLabs (NEB)</td> <td>R0144L</td><td></td></tr><tr><td>3&acute;-O-Me-m7G(5')pp(5')G RNA Cap Structure Analógico</td><td>NEB</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glicose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 grânulos</td><td>Gibco</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>E-Plate 96</td><td>Agilent</td><td>5232376001</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>459844-4L</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Lonza.com</td><td>Kit de Síntese de RNA HiScribe SP6 14-503F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>New England BioLabs (NEB)</td><td>E2070S</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Recombinante Humana IL-2</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Marcadores de RNA do Milênio</td> Kit de Limpeza de RNA <td>Monarca Invitrogen</td><td>AM7150</td><td></td></tr><tr><td>(500 &mu; g)</td> <td>NEB</td><td>T2050L</td><td></td></tr><tr><td>N1-Metilpseudo-UTP</td><td>Trilink</td><td>N-1081-10</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de Transfecção de Néon</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Transfecção de Néon 100-&mu; L Kit</td><td>Invitrogen</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>14-503F</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio</td><td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>25300120</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593049</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Instrumento de Análise Celular em Tempo Real (RTCA)</td><td>Agilent</td><td>RTCA MP</td><td></td></tr><tr><td>ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4201</td><td></td></tr></tbody></table>

uma abordagem não viral para gerar células t receptoras de antígeno quimérico transitório usando mrna para imunoterapia contra o câncer

A Nonviral Approach to Generate Transient Chimeric Antigen Receptor T Cells Using mRNA for Cancer Immunotherapy

Construímos um CAR direcionado a HER2 de segunda geração contendo um scFv derivado do anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) anti-HER2 humanizado 4D547, uma região transmembrana e um domínio coestimulatório intracelular 4-1BB seguido pelo domínio de ativação CD3ζ (Figura 1A). A sequência de DNA que codifica o CAR continha um promotor 5 'SP6 para conduzir a transcrição do mRNA do CAR in vitro ( Figura 1B ). O mRNA do CAR tinha a...

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

Chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy has emerged as a pioneering cancer treatment, achieving unprecedented success in treating certain ...

a-nonviral-approach-to-generate-transient-chimeric-antigen-receptor-t

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Este vídeo demonstra uma técnica para fabricar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) ex vivo. As células T humanas são incubadas com esferas magnéticas revestidas com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, juntamente com um meio suplementado com interleucina-2 (IL-2), levando à ativação e proliferação de células T. Vetores lentivirais transgênicos são introduzidos, permitindo que o RNA transgênico se integre ao genoma do hospedeiro e expresse o transgene. Isso resulta nas células T...

Uma técnica ex vivo para fabricar células T receptoras de antígeno quimérico

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação,...

Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

O atual combina de protocolo único celular emparelhado humana TCR alfa e beta cadeia sequenciamento com simplificada geração de vetores retrovirais compatíveis com expressão de TCR in vitro e in vivo .

Aerodinâmico única célula TCR isolamento e geração de vetores retrovirais para In Vitro e In Vivo de expressão de TCRs humanas

Descrevemos uma abordagem para gerar de forma confiável células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) e testar sua diferenciação e função in vitro e in vivo.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) para imunoterapia adotiva

Este protocolo descreve a metodologia para rastreamento não invasivamente de células T geneticamente modificadas para expressar receptores de antígeno quimérico in vivo com uma plataforma clinicamente disponível.

Imagem dinâmica das células T do receptor de antígeno quimérico com [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Tomografia Computadorizada

Este artigo detalha o processo de fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico para uso clínico, especificamente usando um processador de células automatizado capaz de realizar transdução viral e cultivo de células T. Fornecemos recomendações e descrevemos armadilhas que devem ser consideradas durante o processo de desenvolvimento e implementação de um ensaio clínico de fase inicial.

Fabricação de células T do receptor de antígeno quimérico em um processador de células automatizado

Esse protocolo agiliza a produção de vetores retrovirais e a transdução de células T murinas, facilitando a geração eficiente de células CAR-T em camundongos.

Geração Eficiente de Células T do Receptor de Antígeno Quimérico Murino (CAR)-T

Este protocolo fornece um fluxo de trabalho simplificado para gerar e testar células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Geração de células T reguladoras do receptor de antígeno quimérico humano

Um protocolo detalhado é fornecido para o uso da tecnologia CRISPR / Cas9 para obter knock-in direcionado altamente eficiente de grandes construções multicistrônicas em células T humanas primárias por meio da via de reparo de DNA de junção de extremidade mediada por homologia (HMEJ). As células T projetadas com este protocolo adaptável ao cGMP mantêm excelente expansão celular, citotoxicidade e produção de citocinas.

Engenharia não viral de células T humanas primárias por meio de integração direcionada de junção de extremidade mediada por homologia de grandes modelos de DNA

Este protocolo descreve as etapas essenciais para o cultivo das células T primárias, incluindo seu isolamento, ativação, expansão e transfecção transitória por eletroporação de mRNA. Além disso, é proposto um fluxo de trabalho e um painel de anticorpos para análise citométrica de fluxo do fenótipo, marcadores de ativação, viabilidade e expressão do receptor de antígeno quimérico (CAR).

Isolamento, cultivo e transfecção transitória de células T humanas primárias para gerar células T do Receptor de Antígeno Quimérico (CAR)

Aprenda a gerar células T CAR transientes usando mRNA não integrativo para imunoterapia contra câncer. Este método não viral oferece maior segurança e custo reduzido comparado à transdução viral tradicional.

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer (Vídeo) | JoVE Journal

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

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