Name: Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Aprenda um método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas usando microscopia de fluorescência.

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Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Rutgers Biomedical Health Sciences.
1. Rotule os esporos com fluorescência intracelular
<ol>
	<li>Manchar 1 x 106 esporos em éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE), Cell Tracker Orange ou Cell Tracker Red (ou corante intracelular de sua escolha) a 5 μM por 30 min a 30 ° C, depois lave com PBS e gire os esporos a 12.000 x g. Repita esta lavagem uma vez.</li>
	<li>Prepare o inóculo de esporos na concentração apropriada para que 25 μL contenham a dose de esporos apropriada para um camundongo.</li>
</ol>
2. Inoculação de camundongo com esporos por aspiração por inalação usando anestesia com isoflurano
CUIDADO: O isoflurano é um agente anestésico volátil e deve ser usado dentro de um gabinete de biossegurança com duto ou capela de exaustão.
<ol>
	<li>Para preparar o frasco de exposição ao isoflurano, coloque um guardanapo dobrado em um frasco Nalgene com tampa de rosca de 1 L e coloque um círculo de malha de plástico sobre o guardanapo como uma plataforma para os ratos. Adicione 2 mL de isoflurano ao guardanapo, feche o frasco e espere 1-2 min para que o gás se equilibre no recipiente.</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
Figura 1: Aparelho para o método de inoculação de esporos em gota aberta de isoflurano. Um guardanapo dobrado é colocado no fundo de um frasco de 1 L com tampa de rosca e, em seguida, uma malha plástica circular é inserida para atuar como uma plataforma para os ratos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol start="2">
	<li>Antes de expor o camundongo à anestesia, prepare uma pipeta com 25 μL do inóculo. Coloque o camundongo no recipiente de isoflurano e incline o recipiente para monitorar a perda do reflexo de endireitamento, onde o camundongo perdeu a consciência e está de cabeça para baixo. Isso geralmente leva cerca de 10 s.</li>
	<li>Monitore a frequência respiratória (FR) até que ela diminua para 50-80 respirações consistentes por minuto (bpm), cerca de 50% da FR em repouso. Isso geralmente leva mais 10 s. Neste momento, remova o mouse do frasco de isoflurano. NOTA: Esta é uma alta concentração de isoflurano, que produzirá uma rápida indução da anestesia, e o camundongo deve ser monitorado de perto. A superdosagem letal de isoflurano é um risco, pois a concentração de isoflurano pode ser variável e a curva dose-resposta ao isoflurano é muito íngreme. Se a frequência respiratória cair abaixo de 50 bpm e/ou for irregular, remova o camundongo do isoflurano, deixe-o se recuperar por 3-5 minutos e tente novamente (no máximo duas tentativas repetidas).</li>
	<li>Confirme a profundidade do anestésico por falta de resposta ao beliscão do dedo do pé. Em seguida, posicione o mouse em decúbito dorsal com uma mão e permita que o mouse respire de 3 a 5 respirações ofegantes regulares com frequência crescente (começando em 50 a 60 bpm) e vigor. Quando isso começar, coloque a ponta da pipeta na parte posterior da orofaringe do camundongo e libere o inóculo durante a inalação. NOTA: Esses suspiros pela boca sacodem a cabeça inferiormente devido ao recrutamento de músculos acessórios para a respiração. Quando a pipeta é inserida durante esses suspiros, a boca deve se abrir a cada suspiro. Se a boca não abrir, o camundongo não está suficientemente anestesiado e provavelmente não inalará o conteúdo da orofaringe. A pipeta deve pressionar a língua, empurrando-a para o fundo e para a frente da boca para evitar a ingestão do inóculo. Quando a pipeta está na boca e o mouse está adequadamente anestesiado, o mouse abre a boca a cada suspiro.</li>
	<li>Com a mão e o polegar segurando o mouse, sinta os crepitações nos aspectos posterior e anterior do tórax do camundongo para confirmar a inalação do inóculo.</li>
</ol>
3. Eutanásia de camundongos
<ol>
	<li>Injete no camundongo por via intraperitoneal um coquetel de 200 mg / kg de cetamina e 24 mg / kg de xilazina 10 minutos antes do ponto de tempo do sacrifício.</li>
	<li>Aguarde 10 minutos após a injeção até que o camundongo entre em um plano cirúrgico de anestesia, confirmado pela falta de resposta ao beliscão do dedo do pé.</li>
</ol>
4. Perfusão de pulmões com PBS e formalina
<ol>
	<li>Pulverize o camundongo anestesiado com etanol a 70%. Use uma tesoura para cortar a pele do camundongo e separe a pele para expor o peritônio por todos os lados. Puxe a pele da metade superior do camundongo sobre a cabeça, puxando os braços da pele.</li>
	<li>Corte a membrana peritoneal no esterno e ao longo da face inferior da caixa torácica, expondo o peritônio. Desloque o fígado inferiormente, revelando o diafragma. Use uma tesoura para perfurar cuidadosamente o diafragma do parênquima pulmonar para evitar perfurar um orifício nos próprios pulmões. NOTA: Perfurar inadvertidamente os pulmões impossibilitará a inflação de ar subsequente.</li>
	<li>Depois que o diafragma é perfurado, o ar entra no tórax, colapsando os pulmões. Corte a caixa torácica do lado esquerdo para revelar o coração. Injete 5-10 mL de PBS no ventrículo direito com uma agulha de 30 G a uma taxa de 1 mL por 5 s (para evitar danos aos vasos), clareando rapidamente os pulmões. CUIDADO: A formalina é uma substância volátil perigosa que deve ser manuseada dentro de um gabinete de biossegurança canalizado ou capela de exaustão.</li>
	<li>Quando terminar, remova a agulha e use uma nova agulha para injetar 5 mL de formalina tamponada a 10% (NBF) no ventrículo direito na mesma taxa.</li>
</ol>
5. Inflar o ar do pulmão perfundido
<ol>
	<li>Remova a metade anterior da caixa torácica. Para expor a traqueia, corte as costelas superiores e as clavículas à direita e à esquerda do pescoço. Tome cuidado para evitar cortar perto da linha média onde a traqueia ficará. Com uma pinça, aperte as costelas e clavículas restantes na linha média do pescoço e puxe superiormente até que a traqueia fique exposta.</li>
	<li>Prepare um fio de sutura de 10 cm de comprimento, puxe-o sob a traqueia e pré-amarre um nó solto na extremidade inferior da traqueia exposta. Prepare uma seringa de ar de 1 mL com um cateter de 18 G. Use uma agulha de 18 G para fazer um orifício na traqueia na extremidade superior da região exposta.</li>
	<li>Coloque o cateter nesse orifício, garantindo um ajuste relativamente apertado para evitar que o ar escape. Injete lentamente 1 mL de ar nos pulmões ao longo de 10 s, observando a inflação pulmonar de todos os lobos. A inflação total resulta nos pulmões envolvendo levemente o coração e preenchendo o volume que ocupam no diafragma não perfurado.</li>
	<li>Puxe o nó firmemente ao redor da traqueia e remova o cateter. Segure a traqueia e use uma tesoura cega para remover os pulmões do mouse, tomando cuidado para não perfurar o pulmão.</li>
</ol>
6. Fixação por imersão e desidratação
<ol>
	<li>Coloque os pulmões na borda superior de um tubo cônico de 50 mL cheio de 20 mL de NBF a 10%. Mantenha os fios de sutura fora da cônica, aperte a tampa e inverta a cônica de forma que os pulmões fiquem suspensos de cabeça para baixo em 20 mL de NBF. Coloque-o a 4 °C por 24-48 h.</li>
	<li>Lave os pulmões em PBS e coloque em uma solução de sacarose-PBS a 30% (p / v) por 72-96 h a 4 ° C para desidratar os pulmões em preparação para a criopreservação. Retirar os pulmões da sacarose, colocá-los num criomoldor com meio de temperatura de corte óptimo (OCT) e congelar a amostra a -80 °C.</li>
</ol>
7. Crioseccionamento
<ol>
	<li>Equilibrar os provetes em crioblocos OCT à temperatura de -20 °C do criostato durante 1 h antes do seccionamento. Corte os blocos em espessuras de 20-100 μm. NOTA: A insuflação do ar pode levar ao aumento da fragilidade da amostra, e o corte com espessura aumentada pode evitar a quebra do tecido durante o seccionamento.</li>
	<li>Colete as seções em lâminas de vidro e deixe secar por 30 min a 1 h para garantir a aderência do tecido à lâmina. NOTA: Os slides podem ser mantidos a -80 °C nesta fase.</li>
</ol>
8. Preparação e bloqueio de slides
<ol>
	<li>Coloque as lâminas no banho PBS (em um prato ou frasco de Coplin) por 30 min em temperatura ambiente (RT) para remover o OCT das lâminas. NOTA: Seções mais grossas (40-100 μm) podem não aderir a lâminas de vidro, bem como seções mais finas, por isso é melhor mantê-las planas e verticais em um prato em vez de colocadas de lado em um frasco Coplin.</li>
	<li>Seque as lâminas após a OCT ter se dissolvido do tecido. Use um lenço para secar o excesso de gotículas do perímetro da lâmina ao redor da amostra de tecido. </li>
	<li>Use uma caneta de Papanicolau hidrofóbica para desenhar um perímetro ao redor da amostra e deixe secar por 5 min.</li>
	<li>Prepare um tampão de bloqueio de solução de bloqueio sem animais com 0,3% de Tween-20 e 1:100 Fc Block em 300 mL por lâmina. NOTA: Para alvos intracelulares, 1% de Tween-20 pode ser usado. Um volume de 300 μL geralmente é suficiente, mas o volume necessário para cobrir totalmente o tecido depende do tamanho do perímetro do marcador hidrofóbico. O tecido não deve secar a partir deste ponto.</li>
	<li>Deixe a solução de bloqueio nas lâminas por 1 h em RT.</li>
</ol>
9. Imunocoloração
<ol>
	<li>Lave a lâmina pipetando o fluido e adicionando 300-500 μL de PBS. Repita a lavagem uma vez.</li>
	<li>Prepare o anticorpo primário AlexaFluor-647 conjugado com rato anti-camundongo EpCAM (clone G8.8) (marcador epitelial das vias aéreas) em solução bloqueadora sem animais com 0,33% de Tween-20 (ou 1% para alvos intracelulares). Adicionar 300 μL desta solução por lâmina e corar durante a noite a 4 °C. NOTA: Os anticorpos devem ser testados empiricamente quanto à concentração, tempo e temperatura da coloração. As secções finas (8-20 μm) são coradas durante 30 min a 37 °C e as secções mais espessas (20-100 μm) a 4 °C durante a noite, utilizando diluições de 1:100 para a maioria dos anticorpos. Se estiver usando anticorpos não conjugados, lave 2x (como acima) e aplique um anticorpo fluorescente secundário por um tempo e temperatura determinados empiricamente. Geralmente, a coloração de anticorpos secundários é feita em RT por 1 h na diluição de 1:1000.</li>
	<li>Remova a solução de anticorpos da amostra e lave a lâmina com 300 mL de PBS por 5 min. Repita esta lavagem uma vez. Seque as lâminas, removendo todo o excesso de fluido da amostra e do vidro circundante.</li>
	<li>Adicione uma gota de mídia de montagem RT soft set (por exemplo, SlowFade Glass) a cada pedaço de tecido. Tome cuidado para evitar bolhas, deixando a garrafa assentar de cabeça para baixo e deixando cair lentamente cada gota sobre os lenços. Coloque uma lamínula de tamanho apropriado para se estender além do sample e do perímetro do marcador hidrofóbico.</li>
</ol>
10. Imagem por microscopia fluorescente
<ol>
	<li>Use um microscópio fluorescente multicanal para escanear seções pulmonares inteiras de maneira imparcial usando uma objetiva com resolução suficiente para resolver esporos individuais e células hospedeiras (por exemplo, Zeiss Axioscan 7 usando objetiva de óleo 20x com NA = 0,8 ou similar). NOTA: Certifique-se de que a potência do laser e o ganho de tensão PMT estejam definidos para maximizar as relações sinal-ruído do alvo sobre o fundo determinado com um controle de fluorescência menos um (FMO).</li>
	<li>Colete blocos de imagem suficientes para capturar todo o lobo pulmonar (por exemplo, ~ 200 blocos de tamanho 400 μm x 400 μm). Use o programa de software do microscópio (por exemplo, Zeiss ZEN 3.7 ou similar) para exportar a imagem do bloco mesclado para processamento posterior.</li>
</ol>
11. Análise espacial via QuPath
<ol>
	<li>No QuPath, um software gratuito de código aberto14, crie um arquivo de projeto e adicione as imagens fluorescentes ao arquivo.</li>
	<li>Classifique os pixels do EpCAM+ como epitélio clicando na opção do menu superior Classificar e, em seguida, em Classificação de pixels &gt; Criar limiar. Selecione a resolução, o canal, o sigma de suavização e o valor limite que melhor identifica a região de destino. Salve o classificador com um nome exclusivo e selecione Criar Objetos.</li>
	<li>Na nova janela Criar objetos , selecione Novo tipo de objeto como Anotação. Para o epitélio pulmonar, defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do orifício para 100 mm2. Não há necessidade de selecionar Dividir objetos aqui. Depois de selecionar OK, as anotações serão criadas e podem ser modificadas a olho nu usando a ferramenta Pincel na área superior esquerda.</li>
	<li>Para classificar os esporos, repita as etapas de 11.3 a 11.4 usando o canal no qual os esporos foram capturados e faça o novo tipo de objeto Detecção em vez de Anotação. Defina o tamanho mínimo do objeto e o tamanho mínimo do furo como 0 mm2 e selecione Dividir objetos.</li>
	<li>Para realizar a análise espacial dos esporos, selecione a opção do menu superior Analisar &gt; Análise espacial &gt; Calcular distância assinada para anotações 2D. As distâncias até o epitélio EpCAM+ serão calculadas para cada esporo detectado. Exporte-os através da opção do menu superior Medir &gt; Exportar Medidas.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Preservando a localização de esporos fúngicos em pulmões para análise de microscopia fluorescente

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<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 G, 1 1/2 agulha (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp; Jarra com tampa de rosca (Nalgene)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>Seringas a granel não esterilizadas Air-Tite 10 mL Luer Lock</td><td>Fisher</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed Injection (solução estéril de xilazina)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador e Diluente Animal-Free, R.T.U.</td><td>Vector</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Winged Blindado IV Cateter com BD Vialon Material 18 G x 1.88 in</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen Purificado Rato Anti-Rato CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&trade;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Laranja CMRA Dye</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta; &nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 micron filtros</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 anticorpo monoclonal</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"</td><td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Seringas Estéreis Fisherbrand para Uso Único (1mL, Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>Glicose Monohidratada</td><td>Azer Scientific&nbsp;</td><td>Graxa de alto vácuo ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solução 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de cetamina</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES Limpadores de tarefas delicadas (4,4'' x 8,4")</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>FST</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Fórceps</td><td>FST</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Formalina Tamponada Neutra (10%) (Azer Scientific)</td><td>Fisher</td><td>22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask frascos de cultura de tecidos, T75, tampas de filtro</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way moldes de embutir</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 Software</td><td>de código aberto</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Silk Suture tamanho da rosca 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>SlidesMicro Slides Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605. </td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de 2 Canetas de Barreira Hidrofóbica ImmEDGE da AP Vector Laboratories Fisher Scientific</td><td></td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Cover Glasses, Retangular (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>Malha de Arame de Plástico Branco</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td><td>Fisher</td><td>BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>microscópio fluorescente multicanal</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Software</td> de <td>microscopia</td> <td>de https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td></tr></tbody></table>

método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

Em última análise, esse método produz imagens imunofluorescentes de pulmões de camundongos usando insuflação fisiológica de ar para deixar as vias aéreas intactas. É importante ressaltar que vários pontos de verificação ao longo do caminho confirmarão que os componentes do protocolo foram executados com sucesso. Durante a inoculação, é importante confirmar que o inóculo foi aspirado sentindo "crepitações" na parede torácica posterior do camundongo que indicam que o líquido entrou nas vias aéreas. Se não houver sensação de crepitação, é possível que o camundongo tenha engolido o inóculo. A perfusão dos pulmões de camundongos com PBS deve resultar em manchas brancas dos pulmões seguidas de clareamento completo de todo o pulmão (Figura 2A). Se houver clareamento incompleto, a perfusão subsequente de formalina não atingirá todas as áreas do parênquima pulmonar (Figura 2B). Ao inflar o pulmão com ar, os pulmões devem se distender lentamente até atingirem o tamanho fisiológico. Depois de amarrar a sutura traqueal para prender o ar dentro dos pulmões, os pulmões não devem se contrair em tamanho. Se o fizerem, o pulmão provavelmente foi perfurado durante o procedimento.
Aqui, mostramos imagens representativas de seções com esporos marcados de Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ (verde) e epitélio bronquiolar colunar EpCAM + (magenta) em pulmões inflados com ar e formalina (Figura 3A, B , respectivamente). Esses esporos se acumulam principalmente dentro dos bronquíolos distais e nos espaços alveolares imediatamente adjacentes a esses bronquíolos distais, provavelmente nos ductos alveolares. Os pulmões inflacionados com fixador impregnado de ar contêm esporos que aparecem com mais frequência dentro dos bronquíolos e se agrupam mais próximos dos bronquíolos (Figura 3A), em vez do fixador líquido onde os esporos aparecem ligeiramente mais dispersos do epitélio bronquiolar (Figura 3B). Por meio da análise espacial QuPath, medimos a distância de esporos individuais até o epitélio bronquiolar EpCAM+ mais próximo para indicar o nível de dispersão dos esporos para longe do bronquíolo e em espaços alveolares mais distais. Mostramos que a insuflação líquida dispersa os esporos mais longe dos bronquíolos em comparação com a insuflação fisiológica do ar (Figura 4A, B). A perfusão vascular por insuflação de ar preserva o posicionamento natural desses esporos nos bronquíolos distais e evita a dispersão artificial desses esporos em espaços alveolares mais distais por instilação de fixador intratraqueal.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
Figura 2: Indicação de sucesso da perfusão pulmonar. (A) Os pulmões perfundidos com sucesso serão completamente brancos. (B) Os pulmões incompletamente perfundidos parecerão rosados ou manchados na aparência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagens representativas da distribuição de esporos em pulmões perfundidos com formalina inflados com ar vs. pulmões inflados com formalina. Observa-se que os esporos fluorescentes intracelulares (verde) estão distribuídos mais próximos do epitélio bronquiolar EpCAM+ (magenta) em (A) pulmões inflados com ar do que em (B) pulmões inflados com formalina. As imagens foram obtidas a partir de cortes com profundidade de 1,2 mm da superfície posterior dos lobos esquerdos de camundongos em cada grupo de tratamento em microscópio fluorescente multicanal com aumento de 20x, e os ladrilhos foram costurados usando software de microscopia. Barra de escala = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
Figura 4: Comparação da distância dos esporos (mm) ao epitélio bronquiolar entre pulmões tratados com esporos inflados com ar e formalina. Pulmões de 3 camundongos por grupo de tratamento foram colhidos, processados e fotografados por 1,5 h após a inoculação com 1 x 106 artroconídios de Coccidioides posadasii cts2 / ard1 / cts3Δ . Quatro cortes por camundongo foram amostrados a 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm e 2,0 mm da superfície posterior do lobo esquerdo, corados e fotografados em um microscópio fluorescente multicanal. Todos os esporos de cada grupo foram detectados e analisados espacialmente no QuPath para determinar a distância (A) até o epitélio bronquiolar colunar EpCAM+ mais próximo e (B) a mediana e os intervalos de confiança de 95% são exibidos em unidades de micrômetros. Esporos de insuflação do ar, n = 11.673. Esporos de insuflação líquida, n = 9.837. O teste t de Mann-Whitney foi realizado devido à falta de normalidade, e p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

efficient-method-for-imaging-murine-lungs-that-preserves-spatial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Nós mostramos, como usar dois fótons de microscopia para a observação da dinâmica de granulócitos neutrófilos nos pulmões infectados, enquanto eles fagocitam patógenos ou produzir neutrófilos armadilhas extracelular (NET).

A observação direta de Fagocitose e NET-formação por neutrófilos em pulmões infectados usando dois fótons Microscopia

Este vídeo descreve um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo para estudar as interações entre células cancerígenas e células estromais, usando agarose para inflação. No protocolo de amostra, o procedimento de insuflação de agarose é descrito antes de observar as interações celulares ao vivo.

Insuflação de agarose de pulmão inteiro: um método de preparação de pulmões para imagens ao vivo ex vivo

Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Descrevemos um não-invasivo multimodal de imagem abordagem baseada na Micro-CT e fluorescência molecular tomografia computadorizada para avaliação longitudinal do rato modelo fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal duplo da bleomicina.

Um Multimodal abordagem de imagem baseado em Micro-CT e fluorescência Molecular tomografia para avaliação Longitudinal de fibrose pulmonar induzida por bleomicina em ratos

Descrevemos a imagem óptica de camundongos infectados com Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) usando fluorescência de enzima repórter (REF). Esse protocolo proporciona uma detecção sensível e específica de M. tuberculosis em modelos animais pré-clínicos para investigação patogenia, terapêutica e vacina.

Mycobacterium tuberculosis em camundongos com fluorescência de enzima do repórter de imagem

Aqui descrevemos um protocolo para determinar a carga fúngica pulmonar em camundongos com aspergilose invasiva pela quantificação de prata de methanamine modificada de Gomori coloração em cortes histológicos. Uso desse método resultou em resultados comparáveis com menos animais comparados a avaliação da carga fúngica por PCR quantitativo de DNA fúngico de pulmão.

Histológica quantificação para determinar o pulmão carga fúngica em aspergilose Experimental

Neste estudo, apresentamos um protocolo para executar dois fotões intravital imagem e célula interação análise na mucosa traqueal murino após infecção com vírus da gripe. O presente protocolo será relevante para pesquisadores estudando a dinâmica de células imunes durante infecções respiratórias.

Interação de célula de imagem latente na Mucosa traqueal durante a infecção de vírus de Influenza usando microscopia Intravital dois fotões

Nesta publicação, descrevemos protocolos para avaliação do desembaraço mucociliar das vias aéreas (MCC) em camundongos in vivo utilizando imagens de radionuclídeos de dupla modalidade. Este protocolo é projetado para uma tomografia computadorizada de emissão de fótons (SPECT) e um protocolo de aquisição de tomografia computadorizada (CT) usando collimadores de corpo inteiro de rato (MWB) em um sistema SPECT/CT duplo.

Avaliação in vivo de liberação mucociliaria em camundongos

Descrevemos o método de análise quantitativa da distribuição de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamanho) nas vias aéreas dos camundongos. O método também pode ser utilizado para a análise de micropartículas e distribuição de nanopartículas nas vias aéreas em vários modelos de condições patológicas.

Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente

Aqui, apresentamos um protocolo para imagem intravital de um Mycobacterium tuberculosis aprovado por BSL-2 atenuado. Cepa no pulmão murino usando uma janela pulmonar permanente. Essa abordagem permite a análise longitudinal com resolução de célula única das interações precoces hospedeiro-patógeno, incluindo localização bacilar, dinâmica vascular e captação de macrófagos dentro do mesmo microambiente pulmonar.

Imagem intravital de Mycobacterium tuberculosis auxotrófico atenuado no pulmão murino durante infecção intravascular precoce

Aprenda um método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas usando microscopia de fluorescência.

Método eficiente para imagens de pulmões murinos que preserva a dinâmica espacial de esporos de fungos nas vias aéreas

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