Isolamento e captação de células dendríticas de pequenas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Nossa pesquisa se concentra na caracterização das vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus e seu papel nas interações parasito-hospedeiro. Investigamos a captação da composição pelas células dendríticas do hospedeiro e a potencial influência na imunomodulação. Demonstramos que os EV de E. granulosus são absorvidos por células dendríticas, influenciando a maturação e a apresentação do antígeno. Também identificamos as principais proteínas imunomoduladoras e antigênicas na carga de EV, que podem influenciar as interações parasita-hospedeiro e as respostas imunes.

Nosso protocolo otimiza a cultura de parasitas in vitro para aumentar a produção de pequenas EV e garante isolamento de alta qualidade e integra ensaios de células dendríticas para estudar a imunomodulação. Pode ser aplicado como um todo ou em partes. Nossa pesquisa futura explorará os efeitos in vivo dos EVs de E. granulosus nas respostas imunes, seu potencial como componentes da vacina e seu impacto nas células dendríticas, micrófagos e modelos imunológicos dessas células.

[Narrador] Para começar, limpe a superfície ventral do camundongo eutanasiado com doença hidática usando álcool 70%. Abra cirurgicamente a cavidade peritoneal para remover os metacestóides desenvolvidos usando tesoura e fórceps. Em seguida, transfira as massas de metacestóides para uma placa de Petri estéril usando uma pinça. Remova o tecido conjuntivo usando uma pinça, se necessário, para liberar os cistos das massas metacestóides. Lave os metacestóides obtidos com PBS suplementado a quatro graus Celsius. Agora, prepare o meio de cultura usando todos os componentes necessários e misture a solução suavemente por inversão. Transfira cinco mililitros do meio de cultura preparado para cada tubo de Leighton. Adicione os parasitas ao meio de cultura e incube os tubos a 37 graus Celsius por cinco dias sem alterar o meio. Coletar o meio de cultura do parasita de cada tubo de Leighton e transferi-lo para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugar o meio recolhido a 300 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius e transferir o sobrenadante para um novo tubo cónico de 15 mililitros. Agora, centrifugue o sobrenadante a 2.000g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante resultante para um novo tubo de 1,5 mililitro usando uma pipeta. Centrifugue o tubo a 10.000g por 30 minutos a quatro graus Celsius para remover detritos de células menores. Usando uma pipeta, transfira o sobrenadante para um tubo adequado para o rotor da ultracentrífuga. Marque um lado do tubo com um marcador. E coloque o tubo no rotor com o lado marcado voltado para cima. Centrifugue os tubos a 100.000g por uma hora a quatro graus Celsius. Despeje o sobrenadante rapidamente e deixe o tubo descansar de cabeça para baixo por um minuto. Lave o pellet com pelo menos três mililitros de PBS para remover as proteínas contaminantes. Ressuspenda o pellet várias vezes usando uma pipeta ao longo de todas as faces do tubo, concentrando-se no lado marcado onde se espera que o pellet esteja. Depois de repetir a ultracentrifugação, ressuspender o pellet em 30 microlitros de PBS. Transfira a amostra ressuspensa para um tubo de 1,5 mililitro e congele as vesículas extracelulares a 80 graus Celsius negativos para armazenamento. Pulverize o camundongo CF-1 fêmea sacrificado de cinco a oito semanas com etanol antes de colocá-lo em uma capa de cultura de tecidos. Coloque o mouse em uma placa de dissecação na posição supina. Usando uma pinça e uma tesoura de dissecação, faça uma incisão vertical em T acima da uretra e estenda-a horizontalmente até o topo das extremidades inferiores. Usando uma pinça, separe a pele ao longo de ambos os membros posteriores para expor os ossos e tecidos da perna. Com as mãos, retire a pele de cada perna depois de empurrar do tornozelo em direção ao abdômen, puxando a pele para o lado oposto, deixando as duas pernas livres de pele. Agora, remova cuidadosamente o fêmur e a tíbia usando uma tesoura e uma pinça, garantindo que não haja quebra. Prenda a ponta de cada osso com uma pinça. E corte os tendões para remover as fáscias musculares ao redor dos ossos. Limpeza completa do tecido muscular com guardanapos de papel. Coloque cada osso removido em um tubo estéril de 50 mililitros contendo dois mililitros de meio RPMI completo suplementado para remover os detritos. Depois de descartar o meio, lave os ossos duas vezes com etanol a 70% por cinco minutos de cada vez. Transfira os ossos lavados para uma placa de Petri estéril e corte as epífises de dois ossos usando uma tesoura de dissecação afiada para acessar as células da medula óssea. Usando uma agulha de calibre 25 presa a uma seringa de 20 mililitros contendo meio completo, lave cuidadosamente as células da medula óssea de cada um dos quatro ossos em uma placa de Petri estéril. Em seguida, homogeneizar suavemente o meio contendo medula iludida pipetando para remover o tecido conjuntivo ósseo e os nódulos celulares. Transfira a amostra para um tubo cônico estéril de 50 mililitros, passando as células por um filtro estéril de células de polipropileno de 70 micrômetros para remover o tecido conjuntivo e os detritos ósseos. Centrifugue as células a 450g por sete minutos a quatro graus Celsius. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante, garantindo que o pellet permaneça aderido à parede do tubo. Depois de incubar as células por um minuto à temperatura ambiente, ressuspendê-las em 500 microlitros de tampão de lise de hemácias e neutralizar o tampão de lise com três mililitros de meio completo. Centrifugue as células a 450g por sete minutos a quatro graus Celsius. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em cinco mililitros de meio completo. Depois de filtrar a amostra conforme demonstrado, conte as células usando um hemocitômetro. Adicione 300 nanogramas por mililitro de ligante tirosina quinase três recombinante murina relacionada à FMS, ou FLT3L, ao meio de cultura. Coloque as células em uma placa de vários poços a uma concentração de uma vez 10 elevado a seis células por mililitro. Incube as células por sete dias a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de dióxido de carbono. No terceiro dia, remova um mililitro de meio de cada poço sem perturbar as células e substitua-o por um mililitro de meio completo fresco pré-aquecido, suplementado com 150 nanogramas por mililitro de FLT3L murino recombinante. As vesículas extracelulares, ou EVs, purificadas do estágio larval de Echinococcus granulosus eram principalmente pequenas EVs com tamanhos variando de 50 a 200 nanômetros, confirmadas por espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão. As células dendríticas derivadas da medula óssea demonstraram diferenciação morfológica ao longo de sete dias, progredindo de células hematopoiéticas pequenas e redondas para células estreladas com extensões citoplasmáticas. Após uma hora de incubação, as células dendríticas capturaram pequenos EVs marcados com fluorescência, que co-localizaram com moléculas de MHCIII em compartimentos endossossomais-lisossômicos, conforme confirmado por microscopia confocal.