Transplante de Pulmão de Bioengenharia Usando Pulmões de Camundongos Descelularizados e Células Endoteliais Humanas Primárias

A bioengenharia de órgãos de tamanho humano requer uma grande quantidade de recursos, o que muitas vezes excede a capacidade dos laboratórios acadêmicos. A redução do custo do desenvolvimento de protocolos iterativos acelerará o progresso da pesquisa neste campo. O objetivo deste estudo é fornecer o protocolo padronizado para bioengenharia pulmonar usando blocos coração-pulmão de camundongos. Ainda não se sabe quais células são apropriadas para a bioengenharia de órgãos e como essas células devem ser integradas à cultura do biorreator de órgãos. Vários tipos de células e condições precisam ser comparados para estabelecer protocolos escaláveis e reprodutíveis.

Os ratos são animais experimentais pequenos e fáceis de manusear. No entanto, embora sejam pequenos, a arquitetura básica do pulmão é semelhante entre os mamíferos. Ao otimizar o protocolo nesta pequena plataforma, podemos ampliar os modelos animais a laser simplesmente multiplicando os resultados otimizados de acordo com o tamanho dos animais. Esta plataforma de bioengenharia pulmonar do tamanho de um camundongo permite que os pesquisadores testem suas células-tronco com eficiência. Essas células geneticamente modificadas podem ser preciosas ou caras para usar em toda a engenharia pulmonar. Além disso, as células derivadas do paciente também podem ser usadas para criar modelos de doenças in vitro.

Os esforços atuais envolvem o teste de vários tipos de células-tronco modificadas e células progenitoras, para descobrir o potencial de proliferação necessário e a capacidade diferencial para a bioengenharia pulmonar. Uma vez identificadas as células adequadas, esta pesquisa será estendida a um modelo animal maior, como suínos.

[Narrador] Para começar, coloque o camundongo sacrificado em decúbito dorsal em uma mesa cirúrgica e fixe os membros. Pulverize etanol a 70% uniformemente sobre o tórax e a superfície abdominal para esterilizá-lo. Em seguida, abra a cavidade abdominal ao longo da linha mediana que se estende até o pescoço, usando uma tesoura de aço inoxidável, e divida o esterno. Ressece o diafragma da parede torácica. Corte a parede torácica ventral para expor as cavidades torácicas e remover o timo. Usando uma sutura de seda 4/0, legar a veia cava inferior e a veia cava superior direita. Corte a aorta abdominal com uma tesoura de aço inoxidável para drenagem. Usando uma seringa estéril de cinco mililitros equipada com uma agulha de calibre 27, injete três mililitros de PBS estéril no ventrículo direito, perfurando a parede do ventrículo. Use uma pinça de Dumont para enrolar uma sutura de seda 4/0 ao redor da artéria pulmonar principal. Em seguida, corte uma janela de dois milímetros sob as válvulas da artéria pulmonar, usando uma tesoura de mola, para acessar a parede do ventrículo direito. Insira o cateter da artéria pulmonar pela janela e prenda-o com a sutura de seda 4/0 pré-enrolada. Injete lentamente dois mililitros de PBS através do cateter da artéria pulmonar, usando uma seringa de cinco mililitros. Canule a traqueia com um cateter traqueal e amarre-a no lugar com uma sutura de seda 4/0. Agora, injete lentamente dois mililitros de ar através do cateter traqueal usando uma seringa vazia de cinco mililitros. Segure o ar por 10 segundos para garantir que não haja vazamento de ar dos pulmões. Remova o bloqueio final do coração e dos pulmões. Em seguida, transfira o bloco coração-pulmão ressecado para uma placa de Petri plástica de 10 centímetros de diâmetro contendo água deionizada, para a descelularização dos pulmões. Incube o bloco por uma hora a quatro graus Celsius. Após a incubação, usando uma seringa de cinco mililitros, injete dois mililitros de água deionizada estéril através do cateter traqueal três vezes. Faça uma pausa após cada injeção para permitir que o líquido saia à medida que os pulmões recuam. Da mesma forma, injete dois mililitros de água através do cateter da artéria pulmonar. Injete dois mililitros de solução Triton X-100 a 0,1% nos cateteres da artéria traqueal e pulmonar. Transfira o bloco coração-pulmão para uma placa de Petri e incube estaticamente na solução Triton X-100 durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, para remover a solução Triton X-100 dos pulmões, injete dois mililitros de água deionizada no cateter traqueal e no cateter da artéria pulmonar e repita-os com dois mililitros de solução desoxicolato a 2%. Depois de remover a solução de desoxicolato dos pulmões, injete dois mililitros de solução molar de cloreto de sódio nos cateteres da artéria traqueal e pulmonar. Incube o bloqueio coração-pulmão por uma hora. Depois de remover a solução de cloreto de sódio com água deionizada, injete dois mililitros de solução de trabalho DNase I nos cateteres da artéria traqueal e pulmonar. Incube o bloqueio coração-pulmão por uma hora. Injete PBS estéril nos cateteres da artéria traqueal e pulmonar para remover a solução de DNase I. Após a descelularização, confirme se os pulmões estão brancos e transparentes nas bordas. Adicione 70 mililitros de meio de crescimento de células endoteliais 2, ou meio de cultura EGM-2, ao recipiente de vidro e coloque a rolha de silicone em cima do recipiente para selá-lo. Monte uma rolha de silicone, uma lata de vidro, tampa de rosca GL45 com tubo, uma garrafa de vidro autoclavável de 250 mililitros e uma tubulação L / S 14 com acessórios de isca usando torneiras de três vias. Insira uma agulha de calibre 20 no septo de silicone da tampa de rosca GL45. Encha os tubos A, B e C com meios de cultura usando uma seringa de 10 mililitros conectada às torneiras um e três. Conecte o cateter de artéria pulmonar do bloco coração-pulmão descelularizado ao tubo C por meio de um encaixe de isca. Certifique-se de que não haja bolhas de ar no cateter ou tubo. Para a injeção de células endoteliais acionada por gravidade, coloque um reservatório de células contendo células endoteliais da veia umbilical humana, ou HUVECs, em um agitador magnético, garantindo que o reservatório esteja 30 centímetros acima da câmara do órgão. Ligue o agitador magnético a uma velocidade de 120 RPM. Abra as torneiras um e dois para permitir que a suspensão celular flua para o andaime descelularizado, via tubo A, tubo C e cateter de artéria pulmonar. Para a perfusão de cultura de órgãos, coloque a câmara do órgão em uma incubadora de dióxido de carbono. Conecte a tubulação B a um cabeçote de bomba conectado a uma bomba pulsátil. Feche a porta de vidro da incubadora. Certifique-se de que a tubulação esteja posicionada corretamente entre a porta e a vedação de borracha. Incube o andaime descelularizado a 37 graus Celsius por três horas para permitir que as células endoteliais se assentem dentro do andaime. Ligue a bomba a uma taxa de seis RPM, resultando em dois mililitros por minuto de perfusão de meio usando tubulação L/S 14. Observe o pulmão descelularizado ligeiramente se expandindo devido à perfusão média. Em seguida, feche a porta da incubadora. Para realizar a mudança de mídia, pare o acionamento da bomba. Conecte uma seringa estéril de 50 mililitros à torneira três e retire 50 mililitros de meio da câmara. Encha outra seringa estéril de 50 mililitros com 50 mililitros de meio pré-aquecido. Injectar a solução num recipiente de vidro e transferir o meio para a câmara através da torneira três, garantindo que a torneira é comutada adequadamente. Reinicie a bomba pulsátil. Colher o bloco coração-pulmão recullularizado após dois dias de cultura de órgãos de perfusão. Os pulmões dos camundongos apareceram brancos e translúcidos após a descelularização, indicando a remoção de componentes celulares, preservando a estrutura pulmonar geral. A análise histológica dos pulmões de camundongos descelularizados revelou estruturas alveolares intactas, sem componentes celulares remanescentes. Pulmões de camundongos recelularizados com três vezes 10 elevado a sete HUVECs após dois dias de cultura de biorreatores baseados em perfusão, exibiram distribuição homogênea de HUVECs. As HUVECs migraram para áreas alveolares periféricas, formando uma rede capilar, como observado em pulmões recuulularizados.