Name: Avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a avaliar a função imunológica de macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular. Este método permite medições sensíveis da respiração mitocondrial em tempo real.

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<meta charset="utf8"></head><body>O etanol prejudica a bioenergética do ar comprimido ao mudar para a respiração dependente de glutamina

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo cônico de 15 mL&nbsp;</td><td>VWR International, Inc.</td><td>21008-670</td><td>Usado para preparar concentrações de estoque de reagentes relacionados às mitocôndrias.</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>M6250</td><td>Usado para cultura de células MH-S.</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>Usado para raspar células MH-S de frascos T-75.</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Instrumento: contador de células</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>AMQAF2000</td><td>Usado para contar o número de células MH-S a serem plaqueadas para experimentos.</td></tr><tr><td>D-glicose&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G8270</td><td>Usado para o meio de base de fluxo extracelular.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>4355720</td><td>Tratamento experimental para células MH-S.</td></tr><tr><td>Soro fetal bovino</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>Usado para cultura de células MH-S.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>G1397</td><td>Usado para cultivar células MH-S.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Usado para o meio base de fluxo extracelular.</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>Software GraphPad</td><td>N/A</td><td>Software para análise estatística. Pode ser baixado após a compra em https://www.graphpad.com/features.</td></tr><tr><td>Células MH-S</td><td>Coleção de cultura de tipo americano</td><td>CRL-2019</td><td>Linha celular de macrófagos alveolares de camundongo.</td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>EUA Scientific, Inc.</td><td>4036-3212</td><td>Usado para preparar concentrações de trabalho de reagentes relacionados às mitocôndrias.</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel: programa de planilha de computador</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Software para organização de dados e cálculos bioenergéticos mitocondriais. Pode ser baixado após a compra em https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>15140122</td><td>Usado para cultivar células MH-S.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-446</td><td>Usado para lavar células MH-S.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWR International, Inc.</td><td>45000-396</td><td>Usado para cultura de células MH-S.</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Pro Software: programa de software de computador para projeto e análise de ensaios</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>O computador está conectado ao instrumento Seahorse XF Pro Analyzer. Transferível de&nbsp; https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium: meio base de fluxo extracelular, pH 7,4</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103334-100</td><td>Usado para preparar concentrações de estoque e trabalho de reagentes relacionados às mitocôndrias e cultura de células MH-S antes de execuções experimentais.</td></tr><tr><td>Kit de Teste de Estresse de Oxidação de Glutamina Seahorse XF</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>103674-100</td><td>Contém estoque BPTES, oligomicina, FCCP e rotenona/antimicina A.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer: bioanalisador de fluxo extracelular</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>Bioanalisador de fluxo extracelular.</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak: cartuchos de pacote de fluxo extracelular de 96 poços, placas de microcultura de fluxo extracelular de 96 poços e solução calibrante</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>Usado para preparar células MH-S para ensaios usando um bioanalisador de fluxo extracelular.</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica</td><td>Santa Cruz Biotecnologia, Inc.</td><td>sc-550678</td><td>Usado para remover mídia de células MH-S.</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>Usado para cultura de células MH-S.</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>P4562</td><td>Usado para o meio de base de fluxo extracelular.</td></tr><tr><td>Frascos T-75</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-200263</td><td>Usado para cultura de células MH-S.</td></tr></tbody></table>

avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

A exposição crônica à EtOH diminui a dependência de glutamina em células MH-S. A glutaminólise é uma via crítica para a respiração mitocondrial, apoiando a glutamina como uma importante fonte de combustível para a bioenergética celular. Para determinar se a exposição crônica ao EtOH altera a dependência das células MH-S da glutamina como fonte de combustível para a respiração mitocondrial, as células MH-S foram tratadas sem controle de EtOH (Con) ou EtOH, e o OCR foi medido ao longo do tempo em resposta a injeções seriadas de reagentes associados à respiração mitocondrial. Os perfis bioenergéticos de OCR em resposta a injeções seriadas de oligomicina (inibidor da ATP sintase), FCCP (desacoplador de prótons) e R/A (inibidores do complexo mitocondrial I e do complexo III, respectivamente) são usados para calcular outros parâmetros da bioenergética mitocondrial, como respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente. Todos os dados mostrados são réplicas biológicas adicionais de Con + meio, Con + BPTES e EtOH + meio, grupos experimentais de células EtOH + BPTES MH-S que foram publicados em Crotty et al.11. Conforme mostrado na Figura 2A, a oligomicina diminuiu o OCR devido à inibição do complexo V, o FCCP aumentou o OCR devido ao desacoplamento mitocondrial do potencial de membrana e à geração de ATP dependente de mitocôndrias12 e o R / A efetivamente desligou o OCR dependente de mitocôndrias. Esses perfis de respostas bioenergéticas de OCR às injeções seriadas são consistentes com o guia do usuário para avaliação do estresse mitocondrial usando um bioanalisador de fluxo extracelular13,14.
Depois que o OCR basal foi medido em células MH-S tratadas com Con e EtOH, uma injeção de controle de mídia ou BPTES, um inibidor da glutaminase 1, foi carregada. Con + meio versus células Con + BPTES MH-S e EtOH + meio versus células EtOH + BPTES MH-S não demonstraram diferenças nos perfis bioenergéticos de OCR (Figura 2A). As células EtOH + BPTES MH-S mostraram uma diminuição na respiração basal dependente de glutamina em comparação com Con + BPTES (medição # 4 em comparação com a medição # 3 na Figura 2A e Figura 2B), sugerindo que EtOH diminui a oxidação basal da glutamina das células MH-S, contribuindo para a respiração mitocondrial. As células EtOH + BPTES MH-S exibiram uma perda da respiração mitocondrial ligada ao ATP dependente de glutamina em comparação com Con + BPTES (Figura 2C). Embora as células EtOH + BPTES MH-S tenham demonstrado uma perda atenuada na respiração máxima dependente de glutamina em comparação com Con + BPTES (Figura 2D), as células EtOH + BPTES MH-S mostraram uma diminuição na capacidade respiratória sobressalente dependente de glutamina em comparação com Con + BPTES (Figura 2E). Esses resultados sugerem que as células EtOH MH-S têm a capacidade de ser mais dependentes da glutamina para respiração, como quando estressadas com FCCP, mas que podem ser incapazes de fazê-lo devido a um aumento na demanda de glutamina ser superado por uma diminuição na biodisponibilidade da glutamina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
Figura 1: Visão geral do fluxo de trabalho para medir a respiração mitocondrial dependente de glutamina e a bioenergética em células MH-S, uma linha celular de macrófagos alveolares de camundongo. Monocamadas de células MH-S cultivadas em poços de placa de microcultura de fluxo extracelular (etapa 3.1) foram incubadas com meio de base de fluxo extracelular com suplementos adicionados (etapa 3.2) a 37 ° C em uma incubadora umidificada não-CO2 por 30 min-1 h (etapa 3.4). O meio de base de fluxo extracelular com adição de suplementos (etapa 3.2) foi usado como controle de meio e para diluir as concentrações de trabalho do inibidor da oxidação da glutamina BPTES até a concentração final de 3 μM, o inibidor do complexo mitocondrial V oligomicina (Oligo) até a concentração final de 0,5 μM, o desacoplador mitocondrial cianeto-p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP) até a concentração final de 0,5 μM e os inibidores do complexo mitocondrial I e do complexo III rotenona/antimicina A (R/A) até 0,5 μM concentração final para carregar as portas A-D no cartucho pak de fluxo extracelular superior (etapa 3.7). A estratégia de injeção para tempos de mistura, espera e medição para a execução experimental usando o bioanalisador de fluxo extracelular foi: 3 min de tempo de mistura, 0 min de tempo de espera e 6 medições de 3 min de tempo de medição para a Porta A (controle de meio ou BPTES); 3 min de tempo de mixagem, 0 min de tempo de espera e 3 medições de 3 min de tempo de medição para Port B (Oligo); 3 min de tempo de mixagem, 6 min de tempo de espera e 3 medições de 3 min de tempo de medição para a Porta C (FCCP); e 3 min de tempo de mixagem, 0 min de tempo de espera e 3 medições de 3 min de tempo de medição para a Porta D (R/A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
Figura 2: O etanol crônico (EtOH) diminui a respiração mitocondrial dependente de glutamina em células MH-S, uma linha celular de macrófagos alveolares de camundongo. As células MH-S não foram tratadas (Con) ou tratadas com EtOH (0,08%, 72 h), e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo do tempo foi medida usando um bioanalisador de fluxo extracelular antes e depois da injeção com controle de meio ou um inibidor de oxidação de glutamina (GLN) (3 μM de BPTES), seguido por injeções seriadas de inibidor do complexo V mitocondrial (0,5 μM de oligomicina, Oligo), desacoplador mitocondrial (0,5 μM de cianeto de carbonila-p-trifluorometoxifenilhidrazona, FCCP) e inibidores do complexo mitocondrial I e do complexo III (0,5 μM de rotenona / 0,5 μM de antimicina A, R / A). (A) Os perfis bioenergéticos OCR foram usados para calcular a respiração basal dependente de glutamina (B), (C) respiração ligada ao ATP, (D) respiração máxima e (E) capacidade respiratória sobressalente. Os pontos lineares representam médias ± SEM (n = 4, #p &lt; 0,05 versus Con + media e *p &lt; 0,05 versus Con + BPTES, ANOVA unidirecional com post hoc de Tukey). As barras representam médias ± EPM (n = 4, *p &lt; 0,05 versus Con + BPTES, teste t de Student). Os dados apresentados são réplicas biológicas adicionais para os grupos experimentais de controle e BPTES tratados com mídia de células MH-S não tratadas e expostas crônicas a EtOH, que são publicadas em Crotty et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular

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Este protocolo fornece uma abordagem bioquímica para medir a taxa de acidificação extracelular (ECAR) e a taxa de consumo de oxigênio (OCR) de células leucêmicas primárias com ensaio de fluxo extracelular. A avaliação do perfil metabólico dessas células ajuda a caracterizar suas demandas, levando a uma terapia personalizada.

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Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.

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A reprogramação metabólica é uma característica e pré-requisito para a polarização de macrófagos M1 e M2. Este manuscrito descreve um ensaio para a medição de parâmetros fundamentais de glicólise e função mitocondrial em macrófagos derivados da medula óssea de camundongos. Esta ferramenta pode ser aplicada para investigar como fatores específicos afetam o metabolismo e o fenótipo do macrófago.

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A glicólise é um marcador metabólico definidor em vários sistemas biológicos. O monitoramento da glicólise medindo o fluxo extracelular de H+ é comum, mas requer correção para ser quantitativa e inequívoca. Aqui, demonstramos como coletar e corrigir dados de fluxo extracelular para distinguir entre fontes respiratórias e glicolíticas de acidificação extracelular.

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Aqui, apresentamos um protocolo gradual para investigar a respiração mitocondrial e função glicolítico em Candida Albicans usando um analisador de fluxo extra.

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Cromatografia líquida acoplada ao índice refrativo ou detecção espectrométrica em massa para perfil metabólito em sistemas livres de células baseadas em lysato

O ensaio de fluxo metabólico celular em tempo real mede a taxa de consumo de oxigênio e a taxa de acidificação extracelular, que corresponde à produção de triptosfato de adenosina mitocondrial e glicolítico, usando sensores de pH e oxigênio. O manuscrito explica um método para compreender o estado energético dos osteoblastos e a caracterização e interpretação do estado bioenergéstico celular.

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Aqui, descrevemos em detalhes métodos para extrair macrófagos da medula óssea, baço e coração infartado e, posteriormente, avaliar o fluxo metabólico em células vivas.

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Este protocolo descreve uma forma econômica de realizar um teste de esforço de glicólise para quantificar a reprogramação metabólica em micróglias primárias de camundongo. Após o isolamento e estimulação inflamatória, a taxa de acidificação extracelular (ECAR) é medida usando reagentes recém-preparados e ajustados pelo pH, seguida pela normalização proteica para permitir uma avaliação precisa e reprodutível das mudanças glicolíticas.

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Avaliação da glutamina como fonte de combustível para macrófagos alveolares expostos ao etanol crônico usando um bioanalisador de fluxo extracelular (Vídeo) | JoVE Journal

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