Name: Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Aprenda ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional usando tecidos FFPE. Este método reduz o tempo de processamento e melhora a detecção de sinais em proteômica espacial.

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<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Comm%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+tumor+heterogeneity+and+diagnostic+profiling+for+advanced+and+immune+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies.</a> Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).</li>
<li>Singhal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaiso+%28ZBTB33%29+subcellular+partitioning+functionally+links+LC3A%2FB%2C+the+tumor+microenvironment%2C+and+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival.</a> Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Patil, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+plasma+cells+predict+outcomes+to+PD-L1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).</li>
<li>Hong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+T+cell+therapy+for+MAGE-A4%2B+solid+cancers+in+HLA-A%2A02%2B+patients%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).</li>
<li>Robbins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-institutional+Assessment+of+Pathologist+Scoring+HER2+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+HER2-Low+a+New+Clinical+Entity+or+Merely+a+Biomarker+for+an+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Ther%22%5BJournal%5D)">Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate.</a> Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).</li>
<li>Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+low+can+you+go%3F+PD-L1+expression+as+a+biomarker+in+trials+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy.</a> Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Performing+Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining.</a> Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunofluorescence%3A+A+Powerful+Tool+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy.</a> Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+%28IHC%29+and+immunofluorescence+%28IF%29+staining+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).</li>
<li>Myers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+automated+slide+stainers+for+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Medl+Lab+Obser%22%5BJournal%5D)">A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).</li>
<li>Schwarze, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+administration+of+CD1c+%28BDCA-1%29%2B+and+CD141+%28BDCA-3%29%2B+myeloid+dendritic+cells+in+combination+with+talimogene+laherparepvec+in+immune+checkpoint+blockade+refractory+advanced+melanoma+patients%3A+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial.</a> J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Koppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+PD-L1+immunohistochemistry+staining+protocols+using+the+antibody+clone+28-8+on+different+staining+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms.</a> Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+Requirements+and+Recommendations+for+Multiplex+Immunofluorescence+Tyramide+Signal+Amplification+Assays+to+Support+Translational+Oncology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies.</a> Cancers. 12 (2), 255(2020).</li>
<li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Multiplex+Immunofluorescence+Panel+for+Immuno-oncology+Studies+on+Formalin-fixed+Carcinoma+Tissue+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens.</a> J Vis Exp. (143), e58390(2019).</li>
<li>Hinck, L., Näthke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cell+and+tissue+organization+in+cancer+of+the+breast+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon.</a> Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).</li>
<li>Alturki, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Immune+Checkpoint+Inhibitors+in+the+Context+of+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment.</a> J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).</li>
<li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+therapy+for+solid+tumours%3A+clinical+dilemmas+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).</li>
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A imunofluorescência altamente multiplexada (mIF) é uma técnica avançada que está revolucionando o campo da análise de tecidos, permitindo a visualização simultânea de vários biomarcadores proteicos em uma única seção de tecido 1,2. Essa capacidade fornece um nível incomparável de detalhes e resolução espacial, o que muitas vezes é crucial para entender as interações entre os tipos de células com morfologias complexas dentro do microambiente do tecido em várias escalas espaciais3. A técnica é particularmente valiosa na pesquisa oncológica, onde pode ser usada para co-localizar biomarcadores tumorais, alvos de drogas proteicas, o status imunológico local e de checkpoint, as interações entre diferentes tipos de células e até mesmo os padrões de colocalização subcelular relacionados ao metabolismo da droga dentro do tecido 4,5,6.
Apesar de seu potencial, a maioria das tecnologias mIF ainda enfrenta desafios significativos, principalmente no equilíbrio entre sensibilidade e taxa de transferência com recursos de multiplexação. Essa limitação é especialmente crítica para a detecção de biomarcadores clínicos que podem apresentar expressão muito baixa, como HER2 e PD-L1 7,8,9. Para ver por que isso acontece, é essencial entender outras modalidades de mIF. Esses métodos tradicionais abriram caminho para plataformas mIF mais sofisticadas, mas vêm com seus próprios conjuntos de vantagens e limitações.
A imunofluorescência direta (IFD) utiliza anticorpos diretamente conjugados a fluoróforos ou a um oligonucleotídeo capaz de recrutar fluoróforos10. Este método é simples de multiplexar, mas sofre de menor sensibilidade e dificuldade em resolver o sinal do fundo do tecido ou artefatos de coloração.
A imunofluorescência indireta (IFI) usa um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário. Isso aumentou o sinal em comparação com o DIF baseado em primário. Quando combinada com projetos aprimorados de células de fluxo, a IFI sequencial pode detectar até 40 biomarcadores em um ensaio 2,11. No entanto, estes ainda sofrem de uma relativa falta de sensibilidade em comparação com as estratégias baseadas em enzimas para amplificação de sinal, como as encontradas nas técnicas de imuno-histoquímica (IHQ).
A imunofluorescência baseada em catálise enzimática é mais frequentemente observada em métodos de IHQ que utilizam peroxidase de rábano (HRP) para deposição de corante cromogênico (DAB) ou fluorescente (por exemplo, amplificação de sinal de tiramida (TSA)). Como esses ensaios são baseados na mesma enzima catalítica, sua sensibilidade de detecção é semelhante, tornando os ensaios multiespectrais de mIF baseados em TSA adequados para aplicações clínicas 2,12. A vantagem da amplificação de sinal baseada em DNA é o alto grau de multiplexação possível, mantendo excelente amplificação de sinal e modularidade. Em contraste, os métodos baseados em HRP são menos modulares e difíceis de otimizar, exigindo ciclos adicionais de desenvolvimento e teste de painéis.
Imunofluorescência de anticorpos com código de barras de DNA O ensaio mIF demonstrado aqui usa uma DNA polimerase para amplificar simultaneamente anticorpos com código de barras de DNA, seguido por ciclos de coloração e descoloração da sonda repórter usando quatro oligonucleotídeos fluorescentes por rodada de imagem (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
Figura 1: Ilustração gráfica do protocolo de ensaio de imunofluorescência multiplex. Anticorpos conjugados com código de barras são adicionados em uma única etapa e os códigos de barras são amplificados simultaneamente. Grupos de quatro sondas fluorescentes são adicionados em cada ciclo, permitindo que quatro marcadores sejam visualizados ao mesmo tempo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Essa adição de anticorpos de rodada única e amplificação de etapa única simplificam muito o protocolo de ensaio. O processo é facilitado por sistemas automatizados de coloração e varredura de alto rendimento, que garantem resultados reprodutíveis de lâmina a lâmina e lote a lote em um grande número de amostras utilizadas em estudos clínicos13.
Uma das principais vantagens dessa tecnologia é sua capacidade de manter alta sensibilidade, permitindo multiplexação extensiva2. O fluxo de trabalho também garante que o rendimento da imagem permaneça alto, abordando assim uma das principais limitações das tecnologias mIF altamente multiplexadas (por exemplo, &gt; 8 biomarcadores) para estudos clínicos. Isso é particularmente importante na pesquisa clínica, onde variações sutis nos alvos de medicamentos de baixa abundância (por exemplo, baixo HER2) entre os pacientes podem fornecer informações críticas sobre a resposta terapêutica.
Além desses atributos-chave, este ensaio também oferece configurabilidade do painel, recursos de imagem de lâmina inteira de alto rendimento e resolução óptica necessária para investigar processos e compartimentos subcelulares, bem como saliências celulares associadas a macrófagos e células dendríticas. A capacidade de investigar fenótipos celulares complexos em várias escalas espaciais é uma vantagem crítica da imagem óptica versus métodos baseados em citometria de massa de imagem (IMC)2.
Neste trabalho, um protocolo para um ensaio de mIF de 8 plex é apresentado usando um corador automático e um scanner de lâmina inteira. Este ensaio inclui um painel de oito anticorpos primários: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 e pan-citoqueratina14. Este painel de marcadores permitirá o imunoperfil do tecido tumoral e a identificação de células encontradas no ambiente tumoral ou estroma. Este protocolo usa um corador de lâmina automatizado para coloração inicial e rodadas de troca de sonda, e a coloração e a imagem podem ser concluídas em 2 dias. Métodos de validação de um ensaio mIF e realização de análise das imagens resultantes também são mostrados.

<table><tbody><tr><td>Clone Anti-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>BC33 (BioCare). Parte de ULT50801</td></tr><tr><td>clone anti-CD4</td><td>Ultivue</td><td></td><td>SP35 (Abcam). Parte de ULT50801</td></tr><tr>clone<td>anti-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>KP1 (BioCare). Parte de ULT50801</td></tr><tr>clone<td>anti-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>C8 / 144B (BioCare). Parte dos ULT50801</td></tr><tr><td>clones anti-citoqueratina + anti-SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>AE1/AE3 (Bethyl Labs) e BC34 (BioCare). Parte do ULT50801, fornecido como uma mistura</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (Thermo). Parte de ULT50801</td></tr><tr><td>clone anti-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>CAL20 (Abcam). Parte de ULT50801</td></tr><tr><td>Clone Ultivue</td><td></td><td>Anti-PDL1</td><td>73-10 (Abcam). Parte do ULT50801</td></tr><tr><td>Microscópio Axioscan.Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>chamado microscópio de fluorescência em texto</td></tr><tr><td>Solução de desparafinamento de ligação</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Solução de recuperação de epítopos de ligação 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>Recipientes abertos de ligação, 30 mL</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detecção de pesquisa de ligação</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>Inserções de titulação de ligação</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>Kit de titulação de ligação</td><td>Leica</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>Bond Universal Covertiles</td><td>Leica</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>Solução de lavagem de ligação 10x concentrado</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX Autostainer</td><td>Leica</td><td></td><td>chamado de "autostainer" no texto</td></tr><tr><td>Software</td> <td>BondRXLeica</td><td></td><td>Versão 6.0 ou posterior</td></tr><tr><td>Lamínulas, espessura #1.5</td><td>Etanol Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>, 200 provas</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE blocos de tecido Os</td> tipos de tecido <td>BioIVT</td><td></td><td>variam</td></tr><tr><td>Ensaio OmniVUE 8-plex (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Citoqueratina/SOX10)</td> <td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>contém todos os outros componentes Ultivue</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td><td>(pH 7,4 com 2,7 mM KCl e 137 mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade</td><td>Mountant Thermo</td><td>P10144</td><td>chamado de "meio de montagem" no texto</td></tr><tr><td>UltiAnalyzer.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue Ampüm de amplificação</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte do ULT50801</td></tr><tr><td>Diluente de anticorpos Ultivue</td><td>Parte</td><td></td><td>do ULT50801</td></tr><tr><td>Tampão de troca Ultivue</td><td>Parte</td><td></td><td>do ULT50801</td></tr><tr><td>Iniciador de troca Ultivue</td><td></td><td></td> Parte <td>do ULT50801</td></tr><tr><td>Neutralizador de troca Ultivue</td><td></td><td></td><td>Parte do ULT50801</td></tr><tr><td>Sondas fluorescentes Ultivue 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>parte de ULT50801</td></tr><tr><td>Sondas Fluorescentes Ultivue 2</td><td>Parte Ultivue</td><td></td><td>de ULT50801</td></tr><tr><td>Mistura de Pré-Amplificação Ultivue</td><td></td><td></td><td>Parte de ULT50801</td></tr><tr><td>Tampão de Sonda Ultivue</td><td></td><td></td> Parte <td>de ULT50801</td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

Seguindo o protocolo acima, o tecido FFPE será corado com múltiplos alvos, e imagens de alta qualidade de todos os marcadores em grupos de quatro foram obtidas (Figura 3A, B). O software de co-registro de imagem permitirá que as imagens do mesmo slide sejam combinadas e co-registradas, como visto na Figura 3C. Resultados semelhantes são mostrados na Figura 4 para uma lâmina de tecido de câncer colorretal (CRC).
O sucesso do protocolo deve ser determinado pela avaliação do padrão de coloração esperado. No exemplo de CRC mostrado, cada um dos alvos corados é expresso no compartimento subcelular esperado, por exemplo, FoxP3 nuclear, CD3 membranoso, CD68 citoplasmático (Figura 4B-D). Cada um dos alvos funcionais é expresso no tipo de célula apropriado, como demonstrado pelo exemplo de co-localização de PD1 e CD3 ou de PDL-1 e CD68, que mostram células T exaustas e macrófagos imunossupressores, respectivamente. A avaliação de uma boa relação sinal-fundo, permitindo a distinção bem-sucedida do sinal positivo verdadeiro do ruído de fundo potencial, geralmente é realizada qualitativamente por patologistas ou especialistas em análise de imagem que confirmam a qualidade da coloração, permitindo uma análise de imagem bem-sucedida. Para confirmar ainda mais a qualidade e o desempenho da coloração, pode-se adicionar uma comparação com o padrão ouro IHC (DAB cromogênico) em seções seriadas (veja o exemplo na Figura 5), bem como uma amostra de tecido de controle positivo, como amígdala humana, que para a maioria dos alvos imunológicos pode ser útil para confirmar o sucesso da coloração. Observe que os cânceres podem apresentar menor expressão de alvos do que a amígdala humana16.
Após a confirmação qualitativa dos resultados, a análise quantitativa pode ser realizada. Neste trabalho, este consiste principalmente em calcular a densidade celular de diferentes fenótipos (número de células/mm2) expressando um determinado alvo ou alvos, bem como calcular os níveis médios de intensidade de alvos funcionais que podem apresentar uma ampla faixa dinâmica de expressão. Ao avaliar a precisão dos ensaios de mIF, cortes seriados corados com os mesmos marcadores devem mostrar sinais comparáveis entre as lâminas, que podem ser vistos qualitativamente na Figura 6. Exemplos de resultados quantitativos de densidades de marcadores únicos em diferentes tipos de tecido são mostrados na Figura 7. A análise de imagem nessas imagens permite que células positivas sejam identificadas, e uma densidade de células positivas correspondente pode ser calculada para cada marcador, bem como a intensidade média do sinal por célula positiva. Isso permite que um coeficiente de variabilidade (CV) seja calculado para cada marcador para avaliar a precisão do ensaio de multiplexação (Tabela 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
Figura 3: Imagens de um núcleo de microarray de tecido (TMA) obtidas de sucessivas rodadas de coloração em protocolo de imunofluorescência 8-plex. (A) Imagem obtida na primeira rodada de imagens, apresentando os marcadores CD8, PD1, PD-L1 e CD68. Após o protocolo de troca, (B) mostra a segunda rodada de imagens na mesma lâmina para a segunda rodada de marcadores CD3, CD4, FoxP3 e CK/SOX10, e (C) mostra uma imagem co-registrada combinando as imagens (A) e (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
Figura 4: Coloração representativa do tecido de câncer colorretal (CCR) com coloração de imunofluorescência 8-plex. A figura mostra fenótipos celulares que podem ser identificados pela co-localização de vários alvos na mesma célula. (topo) Imagem de lâmina inteira do tecido do CCR. (parte inferior) Visualizações detalhadas de regiões de tecido destacando (A) células T-reg (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) células que expressam PD-1 e PD-L1 dentro do tumor e estroma, (C) células T citotóxicas exaustas (CD3+/CD8+/PD-1), (D) células tumorais que evitam imunidade (PD-L1+/CK+) e macrófagos imunossupressores (CD68+/PDL1+). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
Figura 5: Comparação qualitativa da imuno-histoquímica (IHQ) com a coloração por imunofluorescência (IF). Cortes seriados corados com coloração imuno-histoquímica de marcador único (DAB, linha superior), imunofluorescência de marcador único (ISP monoplex) e visão de canal único de imunofluorescência multiplex (ISP multiplex) demonstrando concordância qualitativa entre os diferentes métodos de coloração. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
Figura 6: Coloração de seção serial. (A) Diagrama mostrando o layout de uma TMA multi-tecido. (B) Imagens representativas de 8 plex de núcleos de tecido de cada tipo de tecido no TMA. (C) Imagens representativas de CD8 em um núcleo de amígdala em seis seções seriadas de TMA coradas em uma única corrida. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
Figura 7: Quantificação da densidade de marcador único por tipo de tecido incluído no TMA. As densidades por tecido são as densidades médias em três núcleos representativos de cada tipo de tecido na lâmina de TMA. O eixo y representa as densidades de marcadores únicos em diferentes tipos de tecido no eixo x, em unidades de células positivas/mm2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
Figura 8: Análise da região de interesse (ROI) do sinal fluorescente relativo comparando o mIF ISP amplificado descrito neste protocolo com o IF indireto. (A) Lâmina representativa corada para CK (esquerda) ou PD-L1 (direita) com cinco ROIs indicadas. (B) Imagens ROI representativas para CK (superior) e PD-L1 (inferior). Intensidade média do sinal alcançada com mIF amplificado (roxo) e IF indireto (azul) para (C) CK e (D) PD-L1 em cinco ROIs, cada uma medindo 100 μm x 100 μm e contendo aproximadamente 200 células. Os valores do eixo Y mostram unidades fluorescentes arbitrárias e as barras de erro mostram desvios padrão (n = 3). (E) A intensidade relativa do sinal alcançada com o mIF ISP amplificado (roxo) e o IF indireto (azul) foi calculada tomando a razão entre o sinal mIF amplificado médio e o sinal IF indireto médio em todas as ROIs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 4: Coeficiente de variância (CV) calculado. O CV de densidade celular positiva e a intensidade média do sinal para as imagens das amígdalas são mostrados na Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

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JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

Aqui nós descrevemos um otimizado multiplex da transcriptase reversa PCR quantitativo protocolo (qRT-PCR) em combinação com uma plataforma microfluídica como ferramenta de triagem de custo e tempo efetivo de alto rendimento para microRNA (miRNA) níveis de expressão, especialmente quando se trabalha com quantidades limitadas de amostra.

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

Usando a tecnologia Luminex Corporation microesfera xMAP, desenvolvemos o imunoensaio multiplexado fluorométrico (MFIA) para serovigilância de várias espécies de animais de laboratório. O MFIA é um microarray de suspensão onde o antigénio controlo de tecido, ou imunoglobulinas são ligados covalentemente a um código de cores de poliestireno microesferas. O método de ensaio MFIA, bem como vários tópicos de resolução de problemas é abordada.

Multiplexados Metodologia de Testes de imunoensaio fluorimétrico e solução de problemas

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Aqui descrevemos um protocolo para multiplex immunohistochemical fluorescente de coloração e de imagem para localização simultânea de múltiplos antígenos associada a câncer de linfoma. Este protocolo pode ser estendido para a análise de colocalization de biomarcadores dentro de todas as secções de tecido.

Coloração imuno-histoquímica fluorescente multiplexada, imagem e análise de amostras histológicas de linfoma

Multiplex fluorescente imunoistoquímica é uma tecnologia emergente que permite a visualização de vários tipos de células dentro de formalina intacta-fixo, parafina incorporado (FFPE) tecido. Apresentados são diretrizes para garantir um multiplex de 7 cores bem sucedido com instruções para otimizar anticorpos e reagentes, preparando slides, design e dicas para evitar problemas comuns.

Otimização, design e evitando armadilhas em manual multiplex fluorescente imuno-histoquímica

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Ensaios automatizados usando microplatas multi-poços são abordagens vantajosas para identificar reguladores de vias, permitindo a avaliação de uma infinidade de condições em um único experimento. Aqui, adaptamos o bem estabelecido protocolo de imagem e quantificação de macropinoso para um formato de microplacão de 96 poços e fornecemos um contorno abrangente para automação usando um leitor de placas de vários modos.

Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados

Neste artigo, um protocolo para amplificação manual do sinal de tiramida (TSA) por imunofluorescência multiplex (mIF) combinado com análise de imagem e análise espacial é descrito. Este protocolo pode ser usado com cortes fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) para a coloração de dois a seis antígenos por lâmina, dependendo do scanner de lâminas disponível no laboratório.

Imunofluorescência Multiplex Combinada com Análise Espacial de Imagens para Avaliação Clínica e Biológica do Microambiente Tumoral

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

A imunofluorescência multiplexada permite a marcação sequencial de múltiplos marcadores de anticorpos dentro de uma única seção de tecido para apoiar a análise espacial da arquitetura do tecido e das populações celulares. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho para a detecção multiplex de marcadores estruturais, estruturais e imunológicos associados à senescência, incluindo preparação manual e automatizada de lâminas, imagens iterativas e análise de células únicas usando software digital de...

Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

Aprenda ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional usando tecidos FFPE. Este método reduz o tempo de processamento e melhora a detecção de sinais em proteômica espacial.

Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

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