Ensaios automatizados de imunofluorescência multiplex de alto rendimento para pesquisa translacional

Estamos desenvolvendo kits para ensaios de imunofluorescência multiplex rápidos e sensíveis. O objetivo aqui é ajudar os pesquisadores a traçar o perfil de diferentes tipos de células que aparecem no tecido FFPE

A imunofluorescência é comumente realizada usando anticorpos secundários marcados com corante ou peroxidase. A imuno-histoquímica tende a ser plex baixo. Os anticorpos secundários marcados com corante sofrem de sinal mais baixo. Os ensaios de amplificação de sinal de tiramida são trabalhosos para otimizar e levam de várias horas a vários dias para serem executados.

Os marcadores dos ensaios vêm pré-otimizados e são significativamente mais rápidos do que outras técnicas. Colocar quatro marcadores leva menos de oito horas e cerca de três horas a mais para cada quatro biomarcadores adicionais.

A capacidade de executar a imunofluorescência multiplex mais rapidamente permitirá que a proteômica espacial seja mais amplamente aplicada e reduzirá a barreira para a compreensão da contextura espacial do tecido.

[Narrador] Para começar, descongele todos os reagentes do kit em temperatura ambiente. Armazene os conjugados de anticorpos, a enzima de amplificação, o iniciador de troca e o neutralizador de troca a menos 20 graus Celsius até o uso. Vórtice, um diluente de anticorpos descongelado. Pipetar o diluente de anticorpos para um recipiente. Centrifugue brevemente e adicione todos os anticorpos no recipiente da solução de coloração de anticorpos 1. Adicione o diluente de anticorpos fornecido em uma diluição de 1 a 100. Em seguida, use uma pipeta para misturar a solução suavemente, evitando vórtices. Vortex a solução misturada de pré-amplificação após o descongelamento para misturar bem. Em seguida, adicione a solução no respectivo recipiente de mistura. Vortex o tampão de amplificação e pipeta misture a enzima de amplificação. Dilua a enzima de amplificação na proporção de 1 para 10 no tampão de amplificação para criar o tampão de amplificação. Misture delicadamente pipetando, evitando o vórtice. Em seguida, vórtice e centrifugue a solução de contracoloração nuclear fornecida e dilua de 1 a 100 em água ultrapura. Em seguida, dilua a solução de sondas fluorescentes 1 em uma proporção de 1 para 20 no tampão da sonda. Insira o tubo de reagente cheio no instrumento para permitir que os volumes de reagente sejam medidos. Navegue até a guia Configuração do slide na parte superior do software do corador automático assim que todos os reagentes estiverem preparados. Clique no botão Adicionar estudo e insira o ID do estudo, o nome do estudo e quaisquer comentários do estudo, conforme necessário. Em Volume de dispensação, selecione 150 microlitros e escolha *Desparafinar 4 etapas como método de preparação. Se não estiver disponível no menu suspenso, abra o menu Configuração do protocolo, marque a caixa de seleção preferida e clique em OK. Depois que o estudo for criado, clique no botão Adicionar slide localizado no lado direito da tela de configuração do slide. Insira um nome exclusivo para o slide em Comentários do slide. Defina o Tipo de tecido para Testar tecido no campo apropriado. Em seguida, escolha 150 microlitros para Volume de distribuição e defina o modo de coloração como Único no menu suspenso à esquerda e Rotina no menu suspenso à direita. Em Processo, escolha IHC e defina o Marcador para solução de coloração de anticorpos. Na seção Protocolos da janela Adicionar slide, selecione Ensaio de coloração 1 para coloração, *Desparafinar 4 etapas para preparação e *HIER 20 minutos com ER2 para HIER. Deixe o Protocolo enzimático definido como traço de asterisco e clique em Adicionar slide quando todos os campos estiverem completos. Depois de adicionar todos os slides, feche a janela Adicionar slide e imprima as etiquetas dos slides, afixando cada um na seção de tecido correspondente. Carregue cada lâmina rotulada na bandeja e coloque os ladrilhos de cobertura em cima de cada seção de tecido. Insira a bandeja deslizante no instrumento e selecione o corante automático correspondente no lado direito da tela do software. Confirme se todas as três bandejas de lâminas e todas as informações do reagente, incluindo reagentes a granel e preparados, estão visíveis. Verifique se os recipientes de reagentes a granel estão adequadamente cheios e se os recipientes de resíduos têm volume suficiente para completar o funcionamento. Em seguida, pressione o botão play para iniciar a execução da coloração e garantir a remoção oportuna das lâminas do corante automático assim que o procedimento for concluído. Coloque as lâminas manchadas no tampão PBS e aplique as lamínulas usando o meio de montagem. Visualize as lâminas usando um microscópio de fluorescência ou scanner de lâminas inteiras com filtros compatíveis com os corantes de ensaio. Para o ensaio de troca, descongele o tampão de troca à temperatura ambiente. Mantenha o neutralizador de troca e o iniciador de troca armazenados a menos 20 graus Celsius até que estejam prontos para uso. Prepare dois recipientes de titulação de reagente e recupere o kit de detecção para uso durante o protocolo de troca. Turbine o buffer de troca. E pipete misture o iniciador de troca. Prepare a solução de troca em seu recipiente designado misturando os volumes necessários do iniciador de troca e do buffer de troca. Misture o conteúdo apenas pipetando. Agora combine a solução fluorescente das sondas 2 com o tampão de troca diluído no respectivo recipiente. Vortex apenas o tampão da sonda e a sonda fluorescente misturam e pipeta misturam a solução final. Coloque o tubo de reagente cheio com todos os reagentes preparados no corante automático. Permita que a máquina execute um teste de imersão em todos os reagentes. Depois de adicionar os slides, defina o marcador como *Negativo. E para Preparação, HIER e Enzima, selecione a opção de traço de asterisco, pois nenhuma desparafinação ou recuperação de antígeno é necessária para o protocolo de troca. Clique em Adicionar slide ao concluir. Depois que todos os slides forem adicionados, feche a janela Adicionar slide e imprima as etiquetas de slide a serem afixadas em cada seção de tecido correspondente. Carregue cada lâmina na bandeja e coloque um ladrilho de cobertura sobre cada seção de tecido antes de colocar a bandeja no corante automático. Agora pressione o botão play para iniciar a corrida. Imagens de um núcleo de microarray de tecido capturadas em duas rodadas de coloração usando um protocolo de imunofluorescência de oito plex mostraram marcadores imunológicos distintos em cada rodada, com co-registro de imagem bem-sucedido combinando ambas as rodadas em um composto unificado. A imagem de lâmina inteira do tecido de câncer colorretal permitiu a identificação de fenótipos imunológicos com base na colocalização de marcadores, incluindo células T reguladoras, células T exaustas e macrófagos imunossupressores. A coloração por imunofluorescência mostrou co-expressão de CD3, CD4 e FoxP3 em células T reguladoras. PD1 e PDL1 em células tumorais e estromais. CD3, CD8 e PD1 em células T citotóxicas exauridas. E CD 68 e PDL1 em macrófagos imunossupressores. A comparação da imuno-histoquímica de marcador único e da imunofluorescência única ou multiplex confirmou a concordância qualitativa nos padrões de coloração em todos os marcadores. A coloração de corte em série em diferentes tipos de tecido confirmou padrões de expressão consistentes de marcadores imunológicos com núcleos de tecido representativos, mostrando coloração bem-sucedida e variabilidade mínima. Cortes de amígdalas corados em seis lâminas seriadas para CD8 demonstraram alta reprodutibilidade com distribuição de sinal quase idêntica em todas as imagens. A quantificação das densidades celulares positivas entre os tipos de tecido mostrou as maiores densidades nas amígdalas e nos linfonodos e as mais baixas no melanoma e no cólon.