Name: Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Aprenda a técnica de imagem ao vivo de longo prazo para estudar o desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila melanogaster após remoção do pupário. Este método confiável permite observar mudanças dinâmicas nas células epiteliais durante a morfogênese.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imagem ao vivo estendida da morfogênese da perna de pupa de Drosophila sem pupúrio

<ol><li>Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+Drosophila+IAP1+determines+caspase+functions+in+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development.</a> J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).</li>
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<li>Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shape+changes+of+ECM-producing+cells+drive+morphogenesis+of+ball-and-socket+joints+in+the+fly+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg.</a> Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).</li>
<li>Hiraiwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+cell+dynamics+during+the+final+shape+formation+of+the+tarsus+in+Drosophila+adult+leg+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging.</a> Dev Genes Evol. , (2024).</li>
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<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>35 mm/prato de base de vidro</td><td>IWAKI</td><td>3911-035</td><td></td></tr><tr><td>Toalhetes de limpeza</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3c Fórceps</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 2-20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>Fly cepa: His2Av-mRFP, sGMCA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59023</td><td></td></tr><tr><td>FV3000</td><td>EVIDENT</td> microscópio <td>confocal invertido</td>FV31S-SW <td></td></tr><tr><td></td> Software <td>EVIDENT</td><td></td><td>para FV3000</td></tr><tr><td>G40L</td><td>Shin-Etsu Silicone</td><td></td><td>silicone graxa</td></tr><tr><td>Micro Cover Glass 18 x 18 mm 0,13-0,17 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slide Glass 76 x 26 mm 0.9-1.2 mm</td><td>MATSUNAMI</td><td>S7213</td><td></td></tr><tr><td>NEO-SABLE Tamanho 0 redondo, fino</td><td>Pincel Pentel</td><td>XZBNR-0</td><td></td></tr><tr><td>SIL300CS-30CC</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>óleo de silicone</td></tr> Sistema <tr><td>de estereomicroscópio SZX7</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringa Terumo 50 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-50ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Fita dupla face transparente</td><td>Scotch&nbsp;</td><td>665-1-12</td><td>Como a camada interna tem adesão mais forte do que a camada externa, a camada interna deve ser usada para fixar as pupas.</td></tr><tr><td>Lente de imersão</td><td>de silicone</td><td></td> UPLSAPO10x EVIDENTE UPLSAPO40XS EVIDENTE <td></td></tr><tr><td>Tesouras de mola Vannas - ferramentas de ciência fina de ponta de 2,5 mm</td><td></td><td>15000-08</td><td>opcionais</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de drosophila após a remoção do pupário

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

Aqui, é descrito um exemplo de imagem ao vivo de 44 horas da perna adulta de Drosophila em desenvolvimento no estágio de pupa. Moscas expressando His2Av-mRFP17 (núcleos de marcação) e sGMCA18 (proteína de ligação à actina marcada com GFP Moesin, marcando actina) foram coletadas no estágio de pupa branca e incubadas por 15 h a 25 ° C. O pupário foi removido e montado de acordo com o protocolo (Figura 2). Imagens da pilha Z do tarso e do pré-tarso, perto da ponta da perna, foram obtidas com sucesso a cada 15 minutos de 16 h a 60 h APF à temperatura ambiente (não estrito, mas próximo a 25 ° C). A primeira metade da série de imagens é mostrada na Figura 3, a segunda metade na Figura 4 e o filme do todo no Filme 1. À medida que o tecido da perna se estreitava rapidamente, as células epiteliais formavam transitoriamente uma estrutura intrigante, a estrutura semelhante ao Partenon, caracterizada por suas projeções apicobasais e conexões basais (Figura 3). A redução da espessura epitelial foi observada mesmo após o contorno estar quase concluído (Figura 4). Todo o processo é visto na Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig1.jpg"> 
Figura 1: A visão geral da formação da forma final do tarso adulto de Drosophila durante o estágio de pupa. Todo o processo foi dividido em cinco estágios com base nas mudanças morfológicas nos níveis tecidual e celular observadas em experimentos de imagem ao vivo de longo prazo. Fotos representativas ou imagens renderizadas na superfície (sinal sGMCA) correspondentes a vários pontos de tempo são mostradas no lado esquerdo. Breves descrições dos eventos em cada estágio estão escritas no lado direito. Essa figura foi modificada de Hiraiwa et al.15. Veja também o filme 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig2.jpg"> 
Figura 2: Remoção de pupário e montagem para imagens ao vivo. (A) Uma pupa branca coletada em um prato. (B) A pupa apareceu em (A) após incubação por 15 h a 25 ° C. A região ciano colorido indica o opérculo. (C) Uma fotografia mostrando uma pupa aderida a um pedaço de fita dupla-face. (D-J) Série de imagens mostrando o procedimento de remoção do pupário. (D) O opérculo é levantado com uma pinça. (E) O opérculo é removido. (F) Uma ponta de fórceps é inserida entre a cutícula pupal e o pupário. (G) O pupário está parcialmente aberto. (H) Uma ponta de fórceps é inserida novamente. (I) O pupário se abriu, deixando apenas uma pequena porção da extremidade posterior. (J) A pupa sendo levantada por um pincel. (K) Um exemplo de vazamento de fluido corporal da pupa. O fluido que sai da ferida cutucada pela ponta de uma pinça é indicado por uma ponta de flecha. (L-N) Imagens e ilustrações mostrando a montagem da montagem. (L) Uma imagem visualizada de cima mostrando pupas colocadas e água destilada no fundo de um prato com fundo de vidro. (M) O prato após a conclusão da montagem da montagem. Graxa de silicone foi colocada ao longo da borda ao redor da parte do vidro e uma lamínula foi colocada na graxa para selá-la. (N) Desenho esquemático do conjunto de montagem da pupa de Drosophila para imagens ao vivo de longo prazo. (O) Uma pupa montada se desenvolveu quase adulta. (P) Uma pupa montada fechando. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig3.jpg"> 
Figura 3: Mudanças dinâmicas de forma nas células epiteliais do tarso em 16-27,5 h APF. (A) Uma ilustração da pupa vista do lado ventral. O retângulo tracejado corresponde à região observada em (B-E). L1: primeira perna, L2: segunda perna, L3: terceira perna. (B,C,D,E) Fotos da imagem ao vivo da parte distal do tarso na mosca que expressa sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta). O tecido se estreita rapidamente e o recuo das regiões articulares progride. (B',C',D',E') Ampliação das regiões cercadas pelas linhas tracejadas em (B,C,D,E), respectivamente. A seta e a ponta da seta em (C') mostram um exemplo de projeções apicobasais e a posição das conexões basais, respectivamente. A estrutura semelhante ao Partenon começa a se formar em (B'), é totalmente formada em (C'), começa a desaparecer em (D') e se torna difícil de ver em (E'). Distal é à direita e dorsal ao topo em todas as figuras. Os estágios são mostrados nos cantos inferiores direitos em (B,C,D,E). Barras de escala: B,C,D,E: 50 μm; B',C',D',E': 10 μm. Essa figura foi modificada de Hiraiwa et al.15. Veja também o filme 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig4.jpg"> 
Figura 4: Mudanças de forma na camada de células epiteliais do tarso em 41-60 h APF. (A, B, C, D) Imagens estáticas do mesmo conjunto de dados sequencial de imagens ao vivo da Figura 3. Retângulos tracejados em (A,B,C,D) são ampliados em (A',B',C',D'), respectivamente. Por volta de 48 h APF (AB '), a formação da forma externa, como alongamento de cerdas, garras e pulvilões, está quase completa. A parte inferior da articulação invaginada moveu-se proximalmente e, em seguida, a formação da estrutura esférica progrediu após cerca de 54 h APF. A diferença morfológica entre o epitélio dorsal e ventral tornou-se aparente (setas duplas e setas duplas abertas em B',C',D'). Após 54 h APF (C-D'), a camada epitelial diminuiu sua espessura sem quase alterar o contorno dos segmentos. Dorsal é para o topo e distal para a direita em todas as figuras. Barras de escala: A, B, C, D: 50 μm; A',B',C',D': 20 μm.Este valor foi citado de Hiraiwa et al.15. Veja também o filme 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig5.jpg"> 
Figura 5: Um exemplo da observação da perna usando a função Bright Z. (A, B) Imagens da região, profundidade e estágio correspondentes da terceira perna da mosca que expressa sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta), com (B) ou sem (A) usando a função Bright Z. (A) Um plano XY a 59,1 μm de profundidade extraído da observação da região do tarso na terceira perna em 16 h APF adquirido sem o uso da função Bright Z. (A') A vista transversal corresponde à linha vertical amarela em (A). A linha vertical em (A') indica o plano focal de (A). (B) Um plano XY a 61,6 μm de profundidade extraído da observação da região do tarso na terceira perna a 16 h APF adquirido usando a função Bright Z. Tanto a tensão PMT quanto a potência do laser foram ajustadas. A visibilidade da imagem é melhorada em comparação com (A). (B') A vista seccional corresponde à linha vertical amarela em (B). A linha vertical amarela em (B') indica o plano focal de (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Um exemplo da configuração do microscópio confocal para imagens ao vivo da região do tarso da perna de 15 a 30 h APF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Filme 1: Imagem ao vivo de longo prazo da parte distal do tarso por 44 h. Foram utilizados os sGMCA (verde) e His2Av-mRFP (magenta) expressando mosca. O plano XY mais representativo foi extraído do mesmo conjunto de dados da Figura 3 e da Figura 4. As pontas das setas indicam exemplos de futuras regiões conjuntas. As células que se movem rapidamente no tecido são células semelhantes a macrófagos. O sinal em forma de corda que se estende ao longo dos segmentos do tarso faz parte do septo. O carimbo de data/hora mostra hh: mm. Distal é à direita e dorsal ao topo. Este filme foi adaptado de Hiraiwa et al.15<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/Movie%201.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

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Aprenda a técnica de imagem ao vivo de longo prazo para estudar o desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila melanogaster após remoção do pupário. Este método confiável permite observar mudanças dinâmicas nas células epiteliais durante a morfogênese.

Imagem ao vivo de longo prazo do desenvolvimento da perna de pupa de Drosophila após a remoção do pupário

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