Name: Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprenda a técnica de eletroporação em organoides corticais humanos fatiados para manipulação gênica. Este método permite estudar função de genes e desenvolvimento neural com aplicações em distúrbios neurodesenvolvimentais.

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<meta charset="utf8"></head><body>Nocaute do gene CRISPR/Cas9 em organoides corticais humanos fatiados via eletroporação

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga PP de 15 mL, cônicos</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL de poliestireno tubo de fundo redondo com tampa de filtro de célula</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços, tratada com nunclon</td><td>Thermo Fisher</td><td>140675</td><td>para hiPSC placa de cultura</td></tr><tr><td>de 6 poços, fixação ultra baixa</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Para cultura organoide</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>Meio prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Compressor de ar</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>703-545-155</td><td>Anticorpo secundário, RRID: AB_2340375; diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Anticorpo secundário, RRID: AB_162543; diluição 1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol</td> Tecnologias <td></td><td>integradas de DNA</td><td>Design personalizado (pedido de 2 nmol)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Tecnologias</td><td>integradas de DNA</td><td>1081060</td><td>100 &micro; g, de Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Anfotericina B (Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Meio de prosencéfalo 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-GFP (frango, policlonal)</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>RRID: AB_300798; diluição 1:2000</td></tr><tr><td>Anticorpo primário anti-PCGF4 (camundongo, monoclonal)</td><td>Millipore</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; diluição 1:300</td></tr><tr><td>Microscópio fluorescente</td><td>ApoTome Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido Ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1043003</td><td>Meio para prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-suplemento (+ vitamina A)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Meio para prosencéfalo 3, 4&nbsp; &nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (máquina de PCR)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>Capilares, vidro borossilicato com filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm de comprimento</td><td>Science Products</td><td>BF120-69-10</td><td>Precisa ser puxado para espessura específica</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72052</td><td>Meio para prosencéfalo 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Collagenase Tipo IV</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>Instalação de Engenharia de Células-Tronco no CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td><td>Linha hiPSC adaptada de célula única do doador saudável</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td>estoque de 1 mg/mL, use 1:1000 diluído para IF</td></tr><tr><td>Dibutiril-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>Meio para prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Meio prosencéfalo 1, 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>Meio para prosencéfalo 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dumont #55 Fórceps, estreito, 11 cm</td><td>Ferramentas de Belas Ciências</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 Sistema de Eletroporação de Onda Quadrada</td><td>Harvard Aparelho BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de Micropipeta Flamejante/Marrom</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>Para extração de microcapilares</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC dba Geneious</td><td>Software versão 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016; Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotídeos sublinhados = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>Meio prosencéfalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>gPCGF4 KO1</td><td>este artigo</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponde às imagens KO na Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>este artigo</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponde ao KO imagens na Figura 3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>feito em casa</td><td></td><td>1 M stock</td></tr><tr><td>Soro de cavalo, inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Recombinante Humana GDNF</td><td>Thermo Fisher</td><td>450-10</td><td>Meio de prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Humano/Camundongo/Rato BDNF Proteína Recombinante Thermo</td><td>Fisher</td><td>450-02</td><td>Meio para prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico (HCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>258148</td><td>Para fazer TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge (cera) Caneta</td><td>Vector Laboraories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Solução de insulina humana</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&nbsp; I9278</td><td>Prosencéfalo médio 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>Meio para prosencéfalo 1&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser 980</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baixo Ponto de Fusão Agarose, ultra puro</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520100</td><td>para incorporação de hCOs durante o seccionamento do vibratomo</td></tr><tr><td>Matriz de Membrana do Porão Matrigel Redução do Fator de Crescimento (TFG),</td><td>Corning</td><td>354230</td> sem LDEV <td>Para cultura</td></tr> <tr><td>de organoidesMatriz Matrigel hESC-Qualificada,</td><td>354277 Corning</td> sem LDEV <td></td><td>Para cultura hiPSC</td></tr><tr><td>MgCl2, 1</td><td>M Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Microinjetor PicoPump + Interruptor de Pé</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Microloader Pipeta Tips 0.5 a 20 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Para carregamento de capilares de vidro</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>Meio de células-tronco</td></tr><tr><td>N-2 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Meio Forebrain 2 e 3&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Próxima Transmissão de Alta Fidelidade 2x PCR Mastermix&nbsp;</td>Câmara de contagem Neubauer <td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Marca</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>Meio neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>Meio para prosencéfalo 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Aminoácidos Não Essenciais</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Meio prosencéfalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15Nuclease-Free</td></tr> <tr><td>Duplex Buffer</td><td>Tecnologias integradas de DNA</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>Meio de incorporação para amostra de tecido congelado</td></tr><tr><td>P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Fisher Chemical</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Molde de Incorporação Peel-A-Way TruncadoT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>Para incorporação de hCOs para vibratomo e crioseccionamento</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain medium 1, 2, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e para meio de células-tronco após nucleofecção</td></tr><tr><td>Placa de Petri 60 mm x 15 mm, Sem Ventilação, Placa de Petri Estéril</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de Eletrodo de Platina, lacuna de 5 mm</td><td>Harvard Apparatus BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>fabricada internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2308</td><td>De Titrachium album; 10 mg/mL estoque</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de Extração de Gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor da via RHO/ROCK (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Meio para prosencéfalo 2&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Citrato de Sódio Dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&nbsp;</td><td>Lâminas de adesão Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 com um LED KL 300</td><td>Olympus</td><td>SZX10</td><td>Ou estereoscópio alternativo</td></tr><tr><td>Thermo Shaker</td><td>Grant bio</td><td>PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td>também conhecido como Octoxinol 9</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>Para fazer TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td> <td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociação enzmye para fazer suspensões de célula única</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>também conhecido como Polissorbato 20</td></tr><tr><td>Sal de Tyrode</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>Vibratório Micrótomo (vibratoma)</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>Wide-Bore 1000 &micro; L Pontas de Filtro Universal Fit</td><td>Corning</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>Prosencéfalo médio 1, 3 e 4&nbsp; (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

A ablação gênica mediada por CRISPR/Cas9 requer o design de gRNAs. Geralmente, direcionar um dos primeiros éxons de um gene de interesse com um par de gRNAs espaçados de 7 a 11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) funciona bem (Figura 1A). Como primeiro teste, a eficiência do reconhecimento do modelo por gRNAs pode ser interrogada in vitro usando um modelo de PCR 26,40,62. O direcionamento eficiente e o corte mediado por Cas9 são visíveis na redução do DNA molde e no aparecimento de produtos de DNA clivado em um gel de agarose ( Figura 1B ). Testes adicionais de gRNA podem ser realizados na linha iPSC que é usada para geração de organoides corticais. Isso requer a nucleofecção de iPSCs, que pode ser visualizada pela expressão bem-sucedida do repórter fluorescente (Figura 1C). O direcionamento eficiente do locus de interesse pode ser verificado pelo sequenciamento de Sanger, resultando em um cromatograma que termina abruptamente ou se sobrepõe ao redor do local de direcionamento (Figura 1D), resultante de um espectro de indels do reparo de quebra de fita dupla por junção de extremidade não homóloga66. Testes de eficiência de RNA guia in vitro e em células iPSC auxiliam na seleção de pares de gRNA eficientes para ablação gênica em organoides corticais.
Antes da eletroporação, os organoides corticais são fatiados, o que suporta a identificação dos lúmens do ventrículo para injeção da mistura de eletroporação (Figura 2A-C). Os organoides injetados são então transferidos para a câmara de eletroporação (Figura 2D). Para a eletroporação, devem ser utilizados organoides corticais com estruturas ventrículo-símile bem desenvolvidas (Figura 2E), enquanto organoides corticais sem estruturas visíveis devem ser descartados (Figura 2F). A mistura de eletroporação contém um corante que permite a visualização dos ventrículos injetados durante o procedimento (Figura 2G). Após 1-3 dias em cultura, os ventrículos direcionados com sucesso são visíveis pelo sinal GFP nativo sob um microscópio fluorescente ( Figura 2H ).
Para uma análise histológica aprofundada, a imuno-histoquímica de criossecções pode ser realizada. Idealmente, vários ventrículos-alvo estão presentes dentro de um organoide cortical eletroporado (Figura 3A, B). As eletroporações mais ideais têm como alvo estruturas semelhantes a ventrículos na região externa do organoide voltada para o exterior (Figura 3C), pois esses são tipicamente os ventrículos mais expandidos. Em alguns casos, a eletroporação pode levar à morte celular excessiva (Figura 3D, E), por exemplo, quando as concentrações de plasmídeo são muito altas ou as configurações de eletroporação são abaixo do ideal. As eletroporações voltadas para o interior do organoide (Figura 3F) geralmente envolvem regiões menos expandidas das estruturas semelhantes a ventrículos em comparação com o exterior. Em nossa experiência, é útil focar a análise quantitativa em regiões definidas do organoide para reduzir a variabilidade. Às vezes, a eletroporação pode causar ruptura da superfície apical (Figura 3G), por exemplo, quando o volume de injeção é muito alto, causando ruptura dos ventrículos, ou quando os pulsos elétricos são muito fortes, levando à delaminação celular. Finalmente, quando dois ventrículos adjacentes são direcionados (Figura 3H), pode ser difícil atribuir os limites das zonas corticais e a origem das células-alvo.
A imuno-histoquímica pode ser usada para verificar o nocaute mediado por CRISPR / Cas9 bem-sucedido no nível da proteína em células de interesse ( Figura 3I ), exemplificado aqui pelo direcionamento da proteína PCGF4 do Complexo Repressivo Polycomb 1 (PRC1)67. A intensidade do sinal pode ser analisada em células GFP-positivas em condições de controle versus experimentais (Figura 3J). Alternativamente, se nenhum anticorpo adequado estiver disponível, as células-alvo podem ser isoladas por FACS de organoides corticais60 e posteriormente analisadas por Sanger ou Sequenciamento de Próxima Geração36. Além disso, a redução dos níveis de proteína também pode ser analisada por meio de Western blotting.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
Figura 1: Projeto e validação de RNA guia para nocaute agudo de genes mediado por CRISPR/Cas9. (A) Ilustração esquemática da estratégia de design de RNA guia (gRNA), com dois gRNAs direcionados a um éxon de um gene de interesse. As setas pretas indicam primers de PCR para preparação de modelos usados para validação de gRNA. (B) Validação da eficiência do gRNA in vitro. Os modelos amplificados por PCR foram digeridos com complexos RNP. Após a clivagem bem-sucedida, duas bandas de tamanhos diferentes são visíveis após a eletroforese em gel (esquerda), enquanto o molde permanece sem cortes para gRNAs de baixa eficiência (direita). (C) Imagem de campo claro (esquerda), fluorescência GFP (meio) e imagens mescladas (direita) de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) 3 dias após a nucleofecção com o complexo RNP e um plasmídeo GFP. Barras de escala: 350 μm. (D) Validação da eficiência do gRNA em hiPSCs por sequenciamento de Sanger de DNA amplificado de células GFP-positivas. Após a clivagem bem-sucedida do DNA de fita dupla, as trilhas de sequenciamento mostram sinais sobrepostos a partir do local alvo do gRNA (topo, KO1). No caso de direcionamento malsucedido, a trilha da sequência de DNA permanece inalterada (inferior, KO2) em comparação com o controle LACZ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
Figura 2: Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados. (A) Ilustração esquemática mostrando o fluxo de trabalho para a eletroporação de organoides corticais humanos (hCOs). Primeiro, os hCOs são seccionados em fatias de 500 μm de espessura. Dois dias depois, a mistura RNP contendo um plasmídeo de expressão GFP e Fast Green é injetada em lúmens de estruturas semelhantes a ventrículos, preferencialmente na região externa de hCOs. Para eletroporação, os hCOs são colocados na câmara de eletroporação. Após vários dias de cultura, um sinal GFP pode ser detectado em áreas eletroporadas. (B) Imagens de seccionamento de vibratome de hCOs. Os organoides são incorporados em agarose de baixo ponto de fusão a 3% em um meio em um bloco (esquerda). O bloco é seccionado em fatias de 500 μm de espessura (meio). Os organoides fatiados são transferidos de volta para a placa de cultura com uma ponta de pipeta de diâmetro largo (direita). (C) Imagens mostrando a injeção da mistura contendo RNP, pCAG-GFP e 0,1% Fast Green em estruturas semelhantes a ventrículos dos organoides. Os organoides são submersos na solução de Tyrode e o capilar de vidro fino é inserido no lúmen do centro das estruturas semelhantes a ventrículos (esquerda). Fórceps são usados para estabilizar os organoides (esquerdo e médio). Os ventrículos do lado de fora dos organoides são direcionados (meio). Os organoides injetados são transferidos para a câmara de eletroporação, ou posteriormente para a placa de cultura, com pontas de pipeta de diâmetro largo (direita). (D) Imagens da câmara de eletroporação, que é composta por uma placa de Petri de vidro e duas lâminas de metal coladas ao vidro. As lâminas de metal servem como eletrodos e contêm orifícios para prender os cabos para conectar ao eletroporador. O lado injetado do hCO, visível através de uma sombra verde, deve estar voltado para o ânodo (pólo positivo, cabo vermelho) (direita). (E) Imagens representativas de hCOs mostrando estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas. O anel mais leve representa a área semelhante à zona ventricular. O círculo mais escuro no centro da estrutura semelhante a um ventrículo representa o lúmen e deve ser direcionado para injeção. (F) Imagens representativas de hCOs sem estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas, que recomendamos não incluir em experimentos futuros. (G) Imagens representativas de hCOs após a injeção da mistura de eletroporação, nas quais as áreas-alvo são visíveis em verde rápido (setas laranja). (H) Imagem representativa de hCO mostrando o sinal GFP nativo 24 h após a eletroporação. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> 
Figura 3: Análise imuno-histoquímica de organoides corticais humanos fatiados eletroporados. (A) Esquema representando um organoide cortical humano eletroporado (hCO) com sinal fluorescente verde. (B) Coloração DAPI (cinza) e imunofluorescência para GFP (verde) de hCO criosseccionado com múltiplos ventrículos eletroporados, 7 dias após a eletroporação. (CH) Imagens de exemplo de diferentes resultados de eletroporação, coradas para GFP (verde) e núcleos (DAPI, cinza). (C) Uma eletroporação ideal com núcleos intactos (ver inserção 1, D), uma estrutura semelhante a um ventrículo não interrompida e células eletroporadas na área voltada para o exterior do organoide, que geralmente é mais expandida. (E) Exemplo de hCO exibindo morte celular maciça na área eletroporada (ver também inserção 2, D), caracterizada por núcleos pequenos, densos em DAPI e distorcidos. (F) Uma eletroporação bem-sucedida direcionada para o interior do organoide, que geralmente é mais difícil de interpretar devido às áreas semelhantes a placas corticais que se fundem com os ventrículos adjacentes. (G) Estruturas semelhantes a ventrículos rompidas no centro da área eletroporada (seta laranja). (H) Um exemplo de hCO contendo vários ventrículos menores que estão parcialmente fundidos e, portanto, difíceis de quantificar. (I) Coloração DAPI (cinza) e imunofluorescência para GFP (verde) e PCGF4 (magenta) 7 dias após a eletroporação de um complexo RNP visando LACZ (gLACZ KO, esquerda) ou PCGF4 (gPCGF4 KO, direita) para nocaute mediado por CRISPR/Cas9. As células circuladas destacam a intensidade reduzida do PCGF4, indicando ablação gênica bem-sucedida. Um sinal uniforme pode ser visto no controle LACZ (esquerda). (J) O gráfico mostra a intensidade quantificada de PCGF4 após imunofluorescência em células GFP-positivas para o controle (gLACZ KO) e o KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) em relação à expressão mediana de PCGF4 na condição gLACZ. Cada ponto representa uma célula. Dados de 3-4 organoides de dois lotes diferentes (cinza e preto) da mesma linha hiPSC. p &lt; 0,0001, teste de Mann-Whitney. Todas as imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de varredura a laser (B, C) ou fluorescente (EI). As imagens representam projeções de intensidade máxima de pilhas z de 10-15 μm de espessura. Linhas tracejadas brancas indicam a superfície apical voltada para o lúmen do ventrículo e as superfícies externas das hCOs. Linhas tracejadas laranja indicam a borda VZ/SVZ nos ventrículos mesclados. Barras de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anticorpo/Corante</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frango anti-GFP</td>
			<td>1:2,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-PCGF4</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Burro Anti-Frango</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Burro Anti-Coelho</td>
			<td>1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>1 mg/mL de estoque; 1:1,000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista de anticorpos e corantes e sua diluição usados para coloração por imunofluorescência.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

electroporation-sliced-human-cortical-organoids-for-studies-gene

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

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Para realizar uma avaliação rápida da função de genes no desenvolvimento de córtex cerebral, que descrevem métodos que envolvem...

Métodos de Estudo da morfogênese neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Eletroporação RNAi no Cortex Cerebral Murina embrionárias

Este vídeo demonstra o protocolo para eletroporação de genes de célula única em neurônios excitatórios e inibitórios em uma variedade de culturas de fatias de hipocampo in vitro. A técnica é útil para examinar funções moleculares e fisiológicas específicas dos neurônios, incluindo mecanismos autônomos celulares e interações de proteínas transsinápticas.

Eletroporação de célula única em culturas organotípicas de fatias cerebrais: uma técnica in vitro para entregar plasmídeos dentro de neurônios-alvo em fatias cerebrais do hipocampo

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica...

Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

O dobro na eletroporação uteral permite atingir populações celulares que são separadas espacial e temporalmente. Esta técnica é útil para visualizar interações entre essas populações celulares usando proteínas fluorescentes em condições normais, mas também após experimentos funcionais para perturbado genes de interesse.

Dupla em Eletroporação utero para atingir populações celulares temporais e espacialmente separadas

Apresentado aqui é um protocolo para eletroporação unicelular que pode fornecer genes em neurônios excitatórios e inibitórios em uma gama de idades in vitro de cultura de fatias hipocampais. Nossa abordagem fornece uma expressão precisa e eficiente de genes em células individuais, que podem ser usadas para examinar funções células autônomas e intercelulares.

Eletroporação unicelular em diferentes culturas organotipápicas de neurônios inibitórios hipocampais e inibidores específicos de classe

A eletroporação de organoides cerebrais de primatas fornece uma abordagem precisa e eficiente para introduzir modificações genéticas transitórias em diferentes tipos de progenitores e neurônios em um sistema modelo próximo ao desenvolvimento do neocórtex (pato)fisiológico de primatas. Isso permite o estudo de processos neurodesenvolvimentais e evolutivos e também pode ser aplicado para modelagem de doenças.

Microinjeção Direcionada e Eletroporação de Organoides Cerebrais de Primatas para Modificação Genética

Culturas de células da retina pintinho embrionárias constituem ferramentas importantes para o estudo da biologia de fotorreceptores. Nós desenvolvemos uma técnica de transferência de gene eficiente com base em ex ovo plasmídeo electroporação das retinas antes da cultura. Esta técnica aumenta consideravelmente a eficiência de transfecção através de protocolos disponíveis atualmente, fazendo a manipulação genética viável para este sistema.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An Ex-ovo Eletroporação Approach

Apresentamos um método que descreve o isolamento e a cultura de explantes cocleares da orelha interna embrionária de camundongos.  Também demonstramos um método para transferência de genes em explantes cocleares por meio de eletroporação de onda quadrada. A cultura de explantes in vitro, juntamente com a técnica de transferência de genes, permite que os pesquisadores estudem os efeitos da alteração da expressão gênica durante o desenvolvimento.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Aprenda a técnica de eletroporação em organoides corticais humanos fatiados para manipulação gênica. Este método permite estudar função de genes e desenvolvimento neural com aplicações em distúrbios neurodesenvolvimentais.

Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

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