Purificação, expansão e fenotipagem baseada em citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais da medula óssea derivadas de camundongos

Nossa pesquisa fornece um método de baixo custo para purificar e expandir células-tronco mesenquimais homogêneas da medula óssea de camundongos. Isso ajuda os pesquisadores a obter células suficientes de alta qualidade com fortes habilidades de crescimento e diferenciação. Um dos principais desafios na pesquisa com células-tronco da medula óssea é desenvolver um protocolo direto e eficaz para isolar células-tronco mesenquimais da medula óssea. Este método permite que as células-tronco mesenquimais da medula óssea cresçam lateralmente, evitando perturbações. Ele usa a terceira passagem, evita efeitos de crescimento adicionais e mantém as células hematopoiéticas ao redor para apoiar a saúde e a função das células-tronco.

[Instrutor] Para começar, mergulhe o camundongo eutanasiado em etanol a 75% por cinco minutos. Usando uma tesoura de dissecção estéril, faça uma incisão de aproximadamente um centímetro no membro posterior, próximo ao tendão de Aquiles. Em seguida, faça uma incisão circular ao redor do membro posterior para expor a tíbia distal. Retire a pele do local da incisão para cima em direção ao quadril para remover a pele de ambos os membros posteriores. Corte ao longo do osso ilíaco para separar a cabeça do fêmur do osso do quadril. Usando um bisturi estéril, remova o máximo possível de tendão e músculo da tíbia e da fíbula para facilitar a lavagem posterior. Retorne os ossos limpos ao prato contendo PBS com penicilina a 2% e estreptomicina antes de movê-los para um capuz estéril. Pegue uma seringa de 50 mililitros e coloque a agulha que acompanha a seringa. Encha a seringa com 20 mililitros de meio alfa MEM e substitua a agulha pela que acompanha a seringa de um mililitro. No capuz estéril, use uma tesoura para cortar ambas as extremidades do fêmur ou tíbia separados. Agora, insira a agulha no osso na borda cortada e lave a medula óssea em uma placa de cultura de células de 100 milímetros contendo meio alfa MEM completo. Continue lavando até que o osso fique visivelmente pálido, indicando extração bem-sucedida da medula. Pipete para cima e para baixo 40 vezes usando uma ponta de pipeta de um mililitro para dispersar quaisquer agregados celulares. Agora, filtre a suspensão celular através de um filtro de célula de 40 micrômetros em um tubo de centrífuga de 50 mililitros para remover detritos, fragmentos de tecido e aglomerados não dispersos. Ajuste o volume total para 15 mililitros com meio alfa MEM completo e transfira a suspensão de células filtradas para uma placa de cultura de 100 milímetros. Segure o prato com as duas mãos e gire-o suavemente 15 vezes em um movimento em forma de oito para distribuir as células uniformemente pelo prato. Por fim, coloque o prato de cultura em uma incubadora de 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e cultive por cinco dias. Esta figura ilustra a progressão morfológica das células estromais da medula óssea desde a extração inicial até a terceira passagem em cultura. As células da medula óssea recém-extraídas pareciam predominantemente mononucleares com gotículas de gordura espalhadas visíveis em todo o campo. No quinto dia de cultivo, as células fusiformes começaram a emergir e atingiram aproximadamente 60% a 80% de confluência, continuando a aumentar em densidade no sétimo dia. Da passagem um à passagem três, as células estromais da medula óssea mantiveram uma morfologia fusiforme ou fusiforme, formaram uma monocamada clara com colônias interconectadas e não mostraram sinais de apoptose, como granularidade citoplasmática ou fragmentação nuclear. A citometria de fluxo confirmou que CD29, CD44 e Sca-1 foram altamente expressos em células estromais da medula óssea. A expressão dos marcadores CD31 e CD45 das linhagens endotelial e hematopoiética foi desprezível. A quantificação do marcador confirmou ainda altos níveis de expressão de CD29, CD44 e Sca-1 em comparação com CD31 e CD45.