Avaliação da sinalização de morte celular por imunofluorescência em um modelo de rato de AVC isquêmico

O AVC isquêmico é a principal causa de morte e incapacidade em todo o mundo. Nosso trabalho é focado em alvos de drogas para AVC. Estamos interessados em vários alvos emergentes, como RUNX1 e catepsinas. Para avaliar esses alvos, desenvolvemos um modelo de rato de AVC isquêmico ocluindo a artéria cerebral média.

Modelamos o AVC isquêmico em ratos inserindo um filamento para ocluir a artéria cerebral média. O modelo de oclusão da artéria cerebral média é o modelo de roedor mais comumente usado para estudos pré-clínicos de AVC combinado com outras técnicas, como TTC, imunofluorescência e coloração TUNEL. Podemos explorar a fisiopatologia do AVC em uma abordagem integrada. Existem alguns desafios técnicos para a imunofluorescência, como a especificidade dos anticorpos, minimizando o fundo de fluorescência e otimizando a relação sinal-ruído, aproveitando as propriedades dos rótulos fluorescentes e os anticorpos específicos. A imunofluorescência nos permite entender a intrincada paisagem da arquitetura celular e as interações moleculares com o modelo de oclusão da artéria cerebral média.

Vários tecidos cerebrais são potencialmente recuperáveis com uma janela de tempo apropriada do derrame. Nossos resultados mostram que a expressão da catepsina B é ativada no número de cérebros de ratos após a oclusão da artéria cerebral média. É acompanhada por aumento da apoptose. Mais estudos sobre o mecanismo subjacente à sinalização da morte celular podem disponibilizar um novo alvo para o medicamento.

Em nosso estudo futuro, continuaremos a explorar potenciais alvos moleculares em vias inflamatórias e sinalização de morte celular. Esperamos que alguns desses alvos descobertos por estudos experimentais possam ser traduzidos em terapia clínica, melhorando assim a sobrevida e a qualidade de vida dos pacientes com AVC.

[Narrador] Para começar, coloque o rato anestesiado em decúbito dorsal e mantenha sua temperatura corporal a 36,5 °C usando um tapete térmico regulado e uma sonda de monitor de temperatura retal. Raspe a pele do pescoço e desinfete-a com uma solução desinfetante iodófora. Em seguida, faça uma incisão na linha média de 2 cm no pescoço e retraia os tecidos moles para expor os vasos carotídeos. Usando uma pinça, isole a artéria carótida comum direita, ou CCA, a artéria carótida externa, ECA, e a artéria carótida interna, ICA. Ligue a ACC proximal direita usando suturas. Em seguida, prenda o ICA e o ECA corretos em sua origem com um microclipe. Insira um monofilamento de náilon revestido com uma ponta redonda de silicone no lúmen do CCA através de uma pequena incisão e dê um nó no CCA para evitar sangramento e deslocamento do monofilamento. Abra o microclipe ICA direito e insira o monofilamento na artéria cerebral média direita, ou MCA, através do coto ICA até que a ponta de silicone oclua a origem da MCA. Corte a parte exposta do monofilamento de náilon e feche a incisão na linha média do pescoço. Após duas horas de oclusão da ACM, abra a incisão no pescoço e desamarre o nó na ACC. Em seguida, retire o monofilamento de náilon para reperfundir o MCA. Após a cirurgia, observe o rato durante a recuperação da anestesia em uma gaiola aquecida mantida com uma esteira de aquecimento com temperatura regulada. Usando a Escala de Avaliação Comportamental Longa de Zaya, avalie a função neurológica duas horas após a oclusão da artéria cerebral média, ou MCAO, e 22 horas após a reperfusão. Depois de isolar todo o cérebro do rato modelo MCAO, congele o cérebro a -20 °C por 20 minutos. Corte o cérebro congelado em seis fatias coronais com uma distância de 2 mm entre as fatias. Manchar as fatias com TTC a 2% durante 15 minutos a 37 °C no escuro. Em seguida, fixe as fatias de cérebro com paraformaldeído a 4% por 24 horas em temperatura ambiente. Fotografe as fatias manchadas usando uma câmera digital configurada para o modo automático para objetos em close-up. Transfira as imagens para um computador e use o software ImageJ para medir o tamanho do infarto. Calcule o tamanho do infarto como a razão entre a soma da área do infarto em todas as seis fatias e a soma da área total do cérebro nas mesmas fatias. Áreas significativas de infarto foram observadas no grupo MCAO em comparação com nenhum infarto no grupo simulado. Para análise de imunofluorescência, fixe o cérebro intacto do rato modelo MCAO em paraformaldeído a 4% por 24 horas. Em seguida, desidrate o cérebro em uma série de gradientes de solução de sacarose nas concentrações de 10%, 15% e 30%, nas concentrações de 10%, 15% e 30%, continuando até que o tecido afunde. Incorpore o cérebro desidratado no composto de temperatura de corte ideal e remova quaisquer bolhas de ar. Congele o cérebro em nitrogênio líquido. Em um criostato, corte o cérebro a uma espessura de 5 μm. Depois de equilibrar as seções cerebrais congeladas em temperatura ambiente, lave-as três vezes com PBS estéril por 5 minutos cada. Delineie o tecido com uma caneta imuno-histoquímica antes de incubar com 20 μg por mL de proteinase K e 0,3% de Triton X-100 em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois de lavar as seções com PBS, aplique 3% de BSA no tecido delineado e incube em temperatura ambiente por uma hora para bloqueio. Substituir a solução de bloqueio pelo anticorpo primário adequado e incubar as secções durante a noite na escuridão a 4 °C. No dia seguinte, lave as seções três vezes com PBS estéril contendo 0,1% de Tween-20 por 5 minutos cada. Adicione o anticorpo secundário apropriado conjugado ao fluoróforo necessário e incube as seções em uma câmara umidificada por uma hora, protegendo-as da luz. Depois de lavar as seções com PBS contendo Tween-20, manche-as com um meio de montagem contendo DAPPI e cubra com lamínulas. Em um microscópio de fluorescência, ajuste o comprimento de onda de excitação para 488 nm, o comprimento de onda de emissão para 520 nm e o tempo de exposição para 500 ms para capturar a seção cerebral corada imIdades. A imunorreatividade à catepsina B foi significativamente aumentada no núcleo isquêmico do grupo MCAO em comparação com o grupo simulado. A imunorreatividade da catepsina B foi significativamente elevada no córtex penumbra do grupo MCAO em comparação com o grupo simulado. Não foi observada diferença significativa na imunorreatividade da catepsina B entre o núcleo isquêmico e o córtex penumbral. Para começar, desidrate as fatias de cérebro fixadas com paraformaldeído do rato modelo MCAO em concentração crescente de etanol por 35 a 50 minutos cada. Em seguida, trate as fatias de cérebro com o agente biológico transparente 1 do tipo óleo de terebintina por 35 a 50 minutos, seguido pelo agente de limpeza 2 por 35 a 50 minutos até que o tecido esteja totalmente transparente. Agora mergulhe as fatias do cérebro nos meios de incorporação 1, 2, 3 e 4 sequencialmente 60 minutos cada. Coloque as fatias de cérebro em um de incorporação, feche-as bem e guarde-as em armazenamento refrigerado para solidificação. Usando o micrótomo, corte o bloco de tecido a 10 μm e corte a 5 μm. Deixar as secções de tecido flutuarem em banho-maria a 45 °C durante 30 segundos e depois transferi-las para lâminas. Após a secagem, desparafinize as seções cerebrais em um agente de limpeza por dois ciclos de 10 minutos cada. Em seguida, reidratar as seções cerebrais em concentrações decrescentes de etanol. Agora enxágue a seção três vezes em PBS por cinco minutos cada. Depois de remover o excesso de umidade, adicione 100 μL de proteinase K a cada seção e incube a 37 ° C por 20 minutos. Após as lavagens com PBS, aplique 100 μL de tampão de equilíbrio da desoxinucleotidil transferase terminal em cada amostra e incube em uma câmara umidificada a 37 ° C por 10 a 30 minutos. Remova o tampão usando papel absorvente e adicione 50 μL de solução de trabalho de rotulagem do kit de ensaio TUNEL. Em seguida, aplique a solução de trabalho DAPPI nas seções e incube no escuro por cinco minutos para contracorar os núcleos. Enxágue as amostras em PBS quatro vezes por 5 minutos cada. Remova o excesso de líquido e sele a corrediça com um meio de montagem anti-desbotamento. Digitalize a lâmina corada usando o sistema de imagem multiespectral Vectra Polaris. A coloração TUNEL mostrou um aumento significativo na apoptose, com mais células positivas para TUNEL no córtex penumbral do grupo MCAO em comparação com o grupo simulado.