Name: Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Aprenda a imaginar e quantificar a morfologia mitocondrial em C. elegans durante o envelhecimento usando microscopia de fluorescência. Este método padronizado permite analisar alterações tecido-específicas em diferentes tecidos do organismo modelo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Analisando a morfologia mitocondrial em C. elegans

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUDR)</td> <td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>para inibição da proliferação</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>para chapas NGM</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>Colesterol</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Microscópio confocal&nbsp;</td><td>Stellaris 5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>solvente para medicamentos</td></tr><tr><td>HistoBond lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>para preparação de lâminas</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>para</td></tr><tr><td>LB LEICA S7E Escopo de dissecação</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Microscópio de dissecação padrão</td></tr><tr><td>LEICA STELLARIS 5</td><td>Leica</td><td></td><td>Microscópio Confocal</td>158101100</tr><tr><td>LEICA THUNDER Leica</td><td></td><td>11525679</td><td>Microscópio Composto</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>pL4440 plasmídeo vetorial vazio</td><td>plasmídeo addgene</td><td>#1654</td><td>para plasmídeo vetorial vazio</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>para solução de alvejante</td></tr><tr><td>Potássio fosfato dibásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>para placas NGM</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>para M9</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>para vermes paralisantes</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>para placas NGM, M9</td></tr><tr><td>Hipoclorito de sódio</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>para solução</td></tr> <tr><td>de lixíviaFosfato de sódio dibásico</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>para</td></tr><tr><td>cloridrato de tetraciclina</td> M9 <td>VWR</td><td>97061-638</td><td>para RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&not; &AElig; Bombas de Vácuo Secas, Padrão, Welch&not; &AElig;</td><td>VWR</td><td>80077-612</td><td>para aspiração</td></tr></tbody></table>

imagem e quantificação da morfologia mitocondrial em c. elegans durante o envelhecimento

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C. elegans é um ótimo modelo para imagens mitocondriais devido ao seu corpo transparente, que permite imagens fáceis de animais vivos sem preparação excessiva de amostras. Além disso, a morfologia mitocondrial em diferentes tecidos pode ser facilmente visualizada usando promotores específicos do tecido para expressar proteínas fluorescentes direcionadas às mitocôndrias. Aqui, myo-3p (para mitocôndrias musculares), vha-6p (para mitocôndrias intestinais) e col-19p (para mitocôndrias hipodérmicas) foram utilizados para impulsionar a expressão de uma GFP direcionada às mitocôndrias (sequência de localização mitocondrial da proteína ATP-1). As mitocôndrias dos músculos da parede corporal de C. elegans exibem morfologia tubular, alinhando-se ao longo das fibras musculares (miofibrilas) (Figura 1A); as mitocôndrias intestinais apresentaram estruturas altamente interconectadas, semelhantes a teias, com alinhamento menos uniforme (Figura 1B); e a hipoderme possui mitocôndrias tubulares que parecem mais arredondadas ou ovais em comparação com o intestino ou músculo (Figura 1C). A morfologia mitocondrial é geralmente consistente em todo o comprimento do verme no músculo e no intestino, mas a hipoderme exibe algumas pequenas diferenças na interconexão das mitocôndrias entre as extremidades proximal e distal do verme. Assim, para obter resultados experimentais reprodutíveis, recomenda-se focar em uma região específica de seus corpos. Aqui, a área entre a faringe e a vulva ~ 100-200 μm abaixo da faringe é consistentemente visualizada.
Para mitocôndrias musculares e hipodérmicas, a imagem sob um microscópio composto fornece resolução suficiente devido ao achatamento das células e aos baixos níveis de luz fora de foco. No entanto, as mitocôndrias intestinais são difíceis de observar com um microscópio composto, pois o grande volume do intestino limita a resolução devido a uma grande quantidade de luz fora de foco de outras seções do intestino (Figura 2). Portanto, recomenda-se obter imagens das mitocôndrias intestinais sob um microscópio confocal para reduzir a luz fora de foco e visualizar a morfologia mitocondrial adequada.
A forma das mitocôndrias é altamente dinâmica e muda com base no ambiente metabólico dos animais23 ou mesmo devido à exposição a rigidez variável do substrato24. Portanto, deixar os animais em lâminas de microscópio por longos períodos de tempo na ausência de uma fonte de alimento e no substrato rígido do vidro pode afetar potencialmente a morfologia mitocondrial. Aqui, este estudo descobriu que as mitocôndrias dos vermes se fragmentam após aproximadamente 30 minutos em uma lâmina em solução M9, com as mitocôndrias hipodérmicas exibindo a maior fragmentação (Figura 3). Portanto, a imagem das mitocôndrias deve ser realizada rapidamente após a preparação da amostra.
Produtos químicos que restringem a mobilidade do verme, incluindo azida de sódio e tetramisol, são comumente usados para imagens ao vivo de C. elegans, já que vermes estacionários são necessários para capturar várias seções z de animais para imagens 3D. Estudos anteriores mostraram que a exposição à azida sódica ou tetramisol pode resultar em fragmentação mitocondrial25. Surpreendentemente, verificou-se que a azida de sódio - mesmo em altas concentrações - teve um impacto limitado na morfologia mitocondrial no músculo ou intestino. No entanto, a hipoderme exibiu fragmentação mitocondrial mais precoce do que os controles M9 (Figura 3). É importante ressaltar que altas concentrações de tetramisol (100 mM) resultaram em fragmentação mitocondrial significativa imediatamente após a exposição em todos os tipos de células. Em comparação, concentrações médias (10 mM) resultaram em fragmentação mais rápida em comparação com um controle M9. Baixas concentrações (1 mM) tiveram um impacto limitado na morfologia mitocondrial. Esses dados sugerem que a utilização de azida sódica pode ser uma opção viável para imagens rápidas de mitocôndrias, enquanto o tetramisol geralmente deve ser evitado.
Como esperado, as mitocôndrias de todos os tecidos de C. elegans exibem fragmentação durante o processo natural de envelhecimento (Figura 4A). A fragmentação pode ser visualizada como mitocôndrias apresentando-se como estruturas mais truncadas e esféricas, que são dramaticamente diferentes das mitocôndrias tubulares lineares exibidas em animais jovens. É importante notar que o intestino aumenta em estruturas autofluorescentes esféricas em uma idade posterior, portanto, deve-se tomar cuidado para não confundir autofluorescência com estruturas mitocondriais reais. Como pode haver variabilidade de mudanças na estrutura mitocondrial entre os vermes, é importante realizar a quantificação da morfologia mitocondrial em um tamanho de amostra significativo, em vez de apenas obter imagens de alguns vermes. Aqui, foi usado o mitoMAPR, que permite a quantificação automatizada da morfologia mitocondrial usando um conjunto diversificado de métricas, incluindo objetos, redes, junções por rede, pontos de junção, comprimento do objeto, pegada mitocondrial, cobertura mitocondrial e área do objeto (Tabela Suplementar 1 e Tabela Suplementar 2). A automação remove o viés subjetivo do usuário. Aqui, relatamos que a métrica de comprimento do objeto é ideal para medir quantitativamente as mudanças na morfologia mitocondrial muscular e intestinal durante o envelhecimento, e métricas de pontos de junção para medir as mudanças na morfologia mitocondrial hipodérmica durante o envelhecimento (Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
Figura 1: Imagens de mitocôndrias em todo o corpo de C. elegans. A imagem mitocondrial foi realizada durante toda a duração do dia 5 de animais adultos cultivados em EV a partir do estágio L1 em animais transgênicos com expressão de MLS::GFP no músculo (A), intestino (B) e hipoderme (C). Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
Figura 2: Comparação da imagem mitocondrial entre microscópio composto e microscópio confocal. A imagem mitocondrial foi realizada em animais adultos de dia 1 cultivados em EV a partir do estágio L1 em animais transgênicos com expressão de MLS::GFP no músculo (A), intestino (B) e hipoderme (C). Barra de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
Figura 3: Avaliação da fragmentação mitocondrial de diferentes tecidos após tratamento com M9, azida sódica e tetramisol. A imagem mitocondrial foi realizada em animais adultos do dia 1 com expressão de MLS::GFP no músculo, intestino e hipoderme. Os animais foram criados em EV a partir do estágio L1. Os animais foram colocados em lâminas contendo M9, azida sódica (1 mM, 10 mM e 100 mM) ou tetramisol (1 mM, 10 mM e 100 mM) e a imagem foi realizada imediatamente após o preparo da lâmina (0 min) ou 15 min ou 30 min após o preparo da lâmina. Imagens representativas são mostradas para n &gt; 5 animais por cepa para 2 réplicas biológicas. Barras de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
Figura 4: Imagem mitocondrial de C. elegans durante o envelhecimento em diferentes tecidos e quantificação da morfologia mitocondrial usando MitoMAPR. (A) A imagem mitocondrial foi realizada em animais adultos nos dias 1, 5, 9, 13 e 15 da idade adulta com expressão de MLS::GFP no músculo, intestino e hipoderme. Os animais foram criados em EV a partir do estágio L1 e movidos para placas EV contendo FUDR a partir do estágio adulto do dia 1. As imagens são representativas de n ≥ 5 animais por cepa para ≥ 3 repetições biológicas. Barra de escala: 5 μm. (B) A quantificação do comprimento do objeto das mitocôndrias musculares e intestinais de vermes nos dias 1, 5, 9, 13 e 15, e a quantificação dos pontos de junção das mitocôndrias hipodérmicas de vermes nos dias 1, 5, 9, 13 e 15. Todos os pontos de dados individuais combinados com a média ± DP. Os gráficos foram plotados e analisados estatisticamente usando um teste t de Student. ns = não significativo, *p &lt; 0,03; **p &lt; 0,002; p &lt; 0,0002; p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dias de vermes</td>
			<td>Número de vermes</td>
			<td>Volume do tampão (mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Números recomendados de minhocas e volumes de buffer ao preparar lâminas.
Figura suplementar 1: Fluxos de trabalho da aplicação de uma única quantificação de imagem usando MitoMAPR e processamento em lote para várias imagens. (A) Fluxo de trabalho de quantificação da morfologia mitocondrial a partir de uma única imagem usando a macro MitoMAPR. (B) Projeção Z de arquivo de imagem 3D bruta usando Fiji (projeção máxima). (C) Recortar a região de interesse da imagem Z projetada. (D) Imagens do esqueleto adquiridas da macro MitoMAPR. Barras de escala: 5 μm. (E) Fluxo de trabalho de quantificação da morfologia mitocondrial de várias imagens usando processo em lote usando macro MitoMAPR. (F) Captura de tela da macro de corte. (G) Captura de tela de um processo em lote para projeção Z. (H) Captura de tela da janela de confirmação de seleção da macro de corte em lote. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Análise quantitativa das métricas de morfologia mitocondrial no tecido muscular de C. elegans . As métricas registradas incluem objetos, redes, junções por rede, pontos de junção, comprimento do objeto, pegada mitocondrial, área do objeto e cobertura mitocondrial, medida em dias diferentes. Os dados fornecem uma base para avaliar as mudanças na morfologia mitocondrial com o envelhecimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela suplementar 2: Efeitos de produtos químicos imobilizadores na morfologia mitocondrial em C. elegans. Os dados incluem medições como objetos, redes, junções por rede, pontos de junção, comprimento do objeto, pegada mitocondrial, área do objeto e cobertura mitocondrial em concentrações e pontos de tempo variados após a preparação da amostra com tampão M9 ou diferentes concentrações de tetramisol e azida de sódio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

imaging-quantifying-mitochondrial-morphology-c-elegans-during

Research

JoVE Journal

Biology

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Aprenda a imaginar e quantificar a morfologia mitocondrial em C. elegans durante o envelhecimento usando microscopia de fluorescência. Este método padronizado permite analisar alterações tecido-específicas em diferentes tecidos do organismo modelo.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

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