Name: Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Aprenda a visualizar a transmissão sináptica induzida por potencial de ação em larvas de peixe-zebra usando microscopia de epifluorescência. Este método acessível permite estudar a função neuromuscular com sensibilidade aprimorada.

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<ol><li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle.</a> Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).</li>
<li>Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+presynaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing presynaptic function.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+ph-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+phluorins+for+optical+measurements+of+presynaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity.</a> Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).</li>
<li>Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+synaptic+vesicle+cycle+revisited%3A+New+insights+into+the+modes+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms.</a> J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).</li>
<li>Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vacuolar-type+h%2B+atpase-mediated+proton+influx+into+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles.</a> J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).</li>
<li>Egashira, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+ph+dynamics+in+gabaergic+synaptic+vesicles+illuminates+the+mechanism+and+kinetics+of+gaba+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).</li>
<li>Schoch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snare+function+analyzed+in+synaptobrevin%2Fvamp+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice.</a> Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).</li>
<li>Takamori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+anatomy+of+a+trafficking+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular anatomy of a trafficking organelle.</a> Cell. 127 (4), 831-846 (2006).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).</li>
<li>Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicles+interchange+their+membrane+proteins+with+a+large+surface+reservoir+during+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling.</a> Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).</li>
<li>Kwon, S. E., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptophysin+regulates+the+kinetics+of+synaptic+vesicle+endocytosis+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons.</a> Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).</li>
<li>Voglmaier, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endocytic+pathways+control+the+rate+and+extent+of+synaptic+vesicle+protein+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling.</a> Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).</li>
<li>Balaji, J., Ryan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vesicle+imaging+reveals+that+synaptic+vesicle+exocytosis+and+endocytosis+are+coupled+by+a+single+stochastic+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).</li>
<li>Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+of+the+vesicular+gaba+transporter+to+functional+vesicle+pools+by+an+atypical+dileucine-like+motif%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif.</a> J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+and+asynchronous+modes+of+synaptic+transmission+utilize+different+calcium+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources.</a> Elife. 2, e01206(2013).</li>
<li>Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatigue+in+rapsyn-deficient+zebrafish+reflects+defective+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release.</a> J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).</li>
<li>Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+synaptic+vesicle+release+at+neuromuscular+synapses+of+mice+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).</li>
<li>Tabares, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+synaptic+function+at+the+neuromuscular+junction+of+a+mouse+expressing+synaptophluorin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin.</a> J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).</li>
<li>Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding+of+luminance+and+contrast+by+linear+and+nonlinear+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina.</a> Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).</li>
<li>Almeida, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+induces+axonal+hotspots+of+synaptic+vesicle+fusion+that+promote+sheath+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth.</a> Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptically+silent+sensory+hair+cells+in+zebrafish+are+recruited+after+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage.</a> Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).</li>
<li>Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+dynamics+of+synaptic+vesicle+trafficking+and+fusion+at+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone.</a> eLife. 5, e13245(2016).</li>
<li>Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+newly+released+synaptic+vesicle+proteins+at+ribbon+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones.</a> iScience. 17, 10-23 (2019).</li>
<li>Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+dynamics+of+single+fused+synaptic+vesicle+proteins+from+a+single+ribbon+active+zone+in+zebrafish+retinal+bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).</li>
<li>Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+neuromuscular+junction+research+prompted+by+the+zebrafish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opinion+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model.</a> Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).</li>
<li>Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneously+recycling+synaptic+vesicles+constitute+readily+releasable+vesicles+in+intact+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).</li>
<li>Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+synaptic+plasticity+in+acute+hippocampal+slices+maintained+in+a+small-volume+recycling-%2C+perfusion-%2C+and+submersion-type+chamber+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system.</a> J Vis Exp. (131), e55936(2018).</li>
<li>Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+axonal+outgrowth+of+identified+motoneurons+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).</li>
<li>Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+motoneurons+and+their+innervation+of+axial+muscles+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish.</a> J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).</li>
<li>Brehm, P., Wen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+neuromuscular+junction%3A+The+power+of+n%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Zebrafish neuromuscular junction: The power of n.</a> Neurosci Lett. 713, 134503(2019).</li>
<li>Ben Fredj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+and+activity-dependent+competition+regulates+axon+arbor+maturation%2C+growth+arrest%2C+and+territory+in+the+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection.</a> J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).</li>
<li>Mandal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+mitochondrial+transport+is+essential+for+organelle+distribution+and+health+in+zebrafish+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons.</a> J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).</li>
<li>Wong, H. C., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+indicators+for+in+vivo+quantification+of+spontaneous+or+evoked+motor+neuron+presynaptic+activity+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).</li>
<li>Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+vesicle+recycling+in+the+synaptic+bouton%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton.</a> Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).</li>
<li>Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensors+and+regulators+of+intracellular+ph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensors and regulators of intracellular ph.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Objetiva de imersão em água 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW sistema de</td><td></td></tr><tr><td>perfusão de fluxo gravitacional de 4 canais</td><td>ALA</td><td>VCPlus-4G</td><td></td></tr><tr><td>Objetiva de 5x</td><td>Olympus</td><td>NPLN5X</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de imagem feita por cliente</td><td>Physiotech</td><td>custum feito</td><td>Uma placa de acrílico preto (10,7 cm de diâmetro, 3 mm de espessura) com um poço (1 cm de diâmetro na parte inferior, 1,5 cm de diâmetro na parte superior) segurando aproximadamente 0,5 ml de perfusato.&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo de E/S digital</td><td>Arduino</td><td>Uno Rev3</td><td></td></tr><tr><td>D-Tubocurarina dicloreto pentahidratado</td><td>Sigma</td><td>93750</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Office Professional Plus 2016</td><td></td></tr><tr><td>Fiji / imageJ</td><td>https://imagej.net/</td> <td>imageJ 1.54f</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>AsOne</td><td>7-562-05 (Dumont #5)</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipeta</td><td>IWAKI</td><td>IK-PAS-5P</td><td>A ponta deve ser aparada e polida até que o diâmetro final seja 1,5; 2 mm.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri de vidro</td><td>AsOne</td><td>1-4564-06</td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Ver. 6.37</td><td></td></tr><tr><td>Aquecedor de solução em linha</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de iluminação LED</td><td>X-cyte</td><td>XYLIS</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Wako</td><td>133-06962</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Manager</td><td>https://micro-manager.org/</td> <td>Ver. 2.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Mini braçadeira magnética para tubo de perfusão</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1553</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td></td></tr><tr><td>Placa de amostra móvel motorizada</td><td>Scientifica</td><td>MMSP</td><td></td></tr><tr><td>Suporte de pipeta</td><td>Narishige</td><td>H-13</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Fio de platina (&phi; 0.1mm)</td><td>Nilaco</td><td>PT-351165</td><td></td></tr><tr><td>Fio de platina (&phi; 0,5 mm)</td> <td>Niaco</td><td>PT-351381</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>AsOne</td><td>8-3086-02 (Pena # 11)</td><td></td></tr> <tr><td>Câmera cMOS científica</td><td>Thorlabs</td><td>CC215MU</td><td></td></tr><tr><td>sal marinho</td><td>NAPQO</td><td>Microscópio estéreo oceânico</td><td></td>instantâneo</tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Estímulo isolater</td><td>AMPI</td><td>ISO-FLEX</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de sucção</td><td>Warner Instruments</td><td>ST-3, 64-1406</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro Theta</td><td>Sutter Instrument</td><td>BT-150-10</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (MS-222)</td><td>TCI</td><td>T0941</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr></tbody></table>

imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Live Imaging of Synaptic Vesicle Recycling in the Neuromuscular Junction of Dissected Larval Zebrafish

Se a amostra dissecada for preparada sem danos graves ao tecido e o eletrodo de estimulação for inserido adequadamente na medula espinhal, uma resposta robusta de pHluorina pode ser obtida por estimulação elétrica de alta frequência ( Figura 4D , E ). A fluorescência basal pré-estímulo foi provavelmente devido à sonda presente na superfície da pré-sinapse. O aumento da fluorescência durante a estimulação reflete a liberação exocitótica da sonda para a superfície. O decaiment...

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Neuronal communication is mediated by synaptic transmission, which depends primarily on the release of neurotransmitters stored in synaptic vesicles (SVs) ...

Estudamos o mecanismo molecular e celular da transmissão sináptica usando a junção neuromascular de larvas de peixe-zebra como sistema modelo. Estamos interessados em esclarecer a moderação regulatória da sinapse em resposta a várias condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo nos permite visualizar a nova transmissão induzida por potencial de ação na junção neuromuscular larval de peixe-zebra com sensibilidade aprimorada.Podemos monitorar a função sináptica provocada pela estimulação moderada, que não foi testada anteriormente. Este protocolo de imagem pode ser realizado sob um microscópio de epifluorescência convencional e não requer necessariamente um microscópio confocal de varredura a laser. Em outras palavras, este método fornece uma plataforma econômica para imagens da função neuromuscular em comparação com outras configurações experimentais.Para preparar 200 mililitros da solução extracelular, misture 6,4 mililitros de cloreto de sódio 3,5 molar, 0,4 mililitros de cloreto de potássio molar, 1 mililitro de HEPES molar, 0,4 mililitros de cloreto de cálcio molar, 0,2 mililitros de cloreto de magnésio molar e 360 miligramas de glicose. Em seguida, adicione água ultrapura para elevar o volume total para 200 mililitros. Adicione 20 microlitros de solução estoque de D-tubocurarina de 15 milimolares para preparar 100 mililitros de solução extracelular com D-tubocurarina 3 micromolar.Para preparar 25 mililitros da solução extracelular contendo 0,02% de tricaína, adicione 0,5 mililitros de solução estoque de tricaína a 25% Usando um extrator de micropipeta, puxe os capilares de vidro até que o diâmetro da ponta meça dentro da faixa de 3 a 10 micrômetros. Encha a pipeta com a solução extracelular.Insira um fio fino de platina em cada abertura do capilar e segure o eletrodo de pipeta de vidro no suporte da pipeta do micromanipulador motorizado. Em seguida, conecte o back-end de cada fio ao isolador de estímulo. Para 25 mililitros de solução extracelular contendo 0,02% de tricaína em uma placa de Petri de vidro, transfira uma larva de peixe-zebra para a placa de Petri para dissecação.Use duas pinças finas para descascar a pele das larvas. Use a primeira pinça para manter as larvas no lugar e aperte a pele do lado dorsal da bexiga natatória com a outra pinça. Em seguida, usando bisturi, remova a bexiga natatória, os órgãos internos e a cabeça.Use uma pipeta de pasteur de vidro com uma ponta polida a fogo para transferir a amostra de peixe-zebra dissecada para a câmara de imagem. Fixe mecanicamente a amostra com um fio de náilon colado a um fio de platina em forma de C para orientá-la em um ângulo aproximadamente paralelo ao eletrodo de estimulação. Perfundir a amostra utilizando um sistema de fluxo por gravidade a uma taxa de 1 mililitro por minuto com uma solução extracelular contendo 3 micromolares de D-tubocurarina.Em seguida, insira o eletrodo de estimulação na medula espinhal. Posicione cuidadosamente a ponta do eletrodo perto dos neurônios motores espinhais, identificados como neurônios positivos para TagRFP localizados no lado ventral da medula espinhal. Avance o eletrodo em um ângulo oblíquo do segmento adjacente até a posição alvo.Para começar em um computador, selecione a região de imagem com base na imagem ao vivo da fluorescência TagRFP. Certifique-se de que a região selecionada inclua vários botões e exclua aqueles próximos ao limite do segmento do corpo. Troque a unidade de filtro de fluorescência GFP fluorescência de flúor para geração de imagens.Em seguida, ajuste a intensidade da fonte de luz para obter uma imagem brilhante no modo de lapso de tempo de 1 hertz sem saturação. Insira o tempo de exposição para 100 no campo milissegundos de exposição da janela do microgerenciador. Configure o software de aquisição de imagem e o dispositivo de entrada e saída digital para sincronizar a aquisição de imagem com a estimulação elétrica.Em seguida, determine a frequência de estimulação, o número de potenciais de ação e o atraso de tempo entre o início da aquisição da imagem e a entrega da estimulação no script Arduino. Com base nessas configurações, calcule o número total de imagens necessárias para aquisição e insira esse valor no campo de contagem da janela de aquisição multidimensional no micromanager. Defina um intervalo de 1 segundo no campo de intervalo para imagens de lapso de tempo de 1 hertz.Para estimulação elétrica, configure o isolador de estímulo para fornecer pulsos de tensão constante de 1 milissegundo de 70 milivolts. Execute o comando digitalizador para iniciar a aquisição da imagem. Monitore o processo para verificar se não há desvio de imagem inaceitável e se o flúor e as respostas são observáveis.Modifique a intensidade da estimulação, como frequência em número de pulsos, ou ajuste a temperatura com base no propósito experimental. Salve as imagens de lapso de tempo como uma pilha de séries temporais TIFF. Sinapses com grandes aumentos de sinal foram selecionadas para análise, embora todos os botões tenham mostrado alterações detectáveis na condição de potencial de ação de 20 hertz 100, Respostas robustas de flúor foram observadas após estimulação elétrica de alta frequência com alterações de fluorescência indicando exocitose durante a estimulação e subsequente decaimento, refletindo endocitose e reacidificação de vesículas sinápticas.As constantes de tempo de decaimento de fluorescência variaram com estímulo, intensidade e temperatura com 20 hertz 25 potenciais de ação mostrando 16,6 segundos, 20 hertz 100 potenciais de ação em 56,8 segundos e 50 hertz 500 potenciais de ação em 62,7 segundos.

live-imaging-synaptic-vesicle-recycling-neuromuscular-junction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo descreve imagens de neurônios individuais ou de células da crista neural em embriões vivos zebrafish. Este método é usado para examinar comportamentos e localização celular actina microscopia de fluorescência usando lapso de tempo confocal.

Imagens ao vivo da motilidade celular e citoesqueleto de actina de neurônios individuais e células da crista neural em embriões Zebrafish

Este protocolo discute a dissecção ao vivo...

Em Visualization vivo das vesículas sinápticas Dentro Drosophila larval Axônios segmentar

Larval zebrafish representar o sistema primeiro modelo vertebrados para permitir a gravação simultânea patch clamp um músculo do neurônio motor e alvo espinhal esquelético. Este vídeo demonstra os métodos microscópicos utilizados para identificar uma CaP segmentar do neurônio motor e células do músculo-alvo, bem como as metodologias para a gravação de cada tipo de célula.

Gravações patch emparelhado Grampo da Motor-neurônio e músculo alvo ósseas em Zebrafish

Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Um dispositivo simples de microfluidos foi desenvolvido para realizar anestésico...

Simples dispositivos microfluídicos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

Este vídeo demonstra um protocolo para estudar a reciclagem de vesículas sinápticas em junções neuromusculares em larvas de Drosophila que expressam channelrodopsina usando um corante fluorescente. A luz azul ativa as channelrodopsinas, causando influxo de cálcio e exocitose de vesículas sinápticas. O corante se integra às membranas neuronais e é internalizado durante a endocitose, resultando em maior fluorescência. A estimulação adicional da luz azul induz exocitose e liberação de corante, o...

Analisando a reciclagem de vesículas sinápticas e a absorção de corantes fluorescentes em larvas de Drosophila

Fonte: Schramm, P. et al. Imagem in vivo de tecido cerebral totalmente ativo em larvas e juvenis de peixe-zebra acordados por remoção de crânio e pele. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demonstra a imagem in vivo de neurônios cerebelares em larvas transgênicas de peixe-zebra, que expressam proteínas fluorescentes em neurônios de Purkinje. O processo envolve anestesiar as larvas, imobilizá-las em agarose e remover cuidadosamente a pele pigmentada para aumentar a penetração da luz e a intensidade da...

Imagem in vivo do cérebro larval de peixe-zebra para visualização de neurônios cerebelares

Fonte: Lukasz, D., et al. Imagem de cálcio in vivo de células ciliadas da linha lateral em larvas de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra imagens ao vivo do influxo de cálcio nas células ciliadas da linha lateral de uma larva de peixe-zebra transgênica paralisada usando um microscópio confocal. A estimulação mecânica dos feixes de cabelo por meio de pulsos de fluido induz a entrada de cálcio através de canais de mecanotransdução e canais dependentes de voltagem, que é...

Imagem da dinâmica do cálcio em células ciliadas da linha lateral de larvas de peixe-zebra

O peixe-zebra é um sistema de modelo que tem muitos recursos valiosos, incluindo claridade ótica, rápido desenvolvimento externo e, de particular importância para o campo de audição e equilíbrio, localizado externamente células sensoriais do cabelo. Este artigo descreve como transgênico zebrafish pode ser usado para ensaiar tanto cabelo-célula mechanosensation e função pré-sináptica em toto.

Na imagem latente de cálcio Vivo de células de cabelo linha Lateral no Zebrafish Larval

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para examinar a atividade neural em regiões cerebrais de peixes-zebra transgênicos que expressam indicadores de cálcio GCaMP usando microscopia confocal.

In vivo Imagem de fluorescência confocal da atividade neural induzida por estimulação sensorial em peixes-zebra larvais parcialmente contidos

Aprenda a visualizar a transmissão sináptica induzida por potencial de ação em larvas de peixe-zebra usando microscopia de epifluorescência. Este método acessível permite estudar a função neuromuscular com sensibilidade aprimorada.

Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

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