Imagens ao vivo da reciclagem de vesículas sinápticas na junção neuromuscular de larvas dissecadas de peixe-zebra

Estudamos o mecanismo molecular e celular da transmissão sináptica usando a junção neuromascular de larvas de peixe-zebra como sistema modelo. Estamos interessados em esclarecer a moderação regulatória da sinapse em resposta a várias condições fisiológicas e patológicas. Este protocolo nos permite visualizar a nova transmissão induzida por potencial de ação na junção neuromuscular larval de peixe-zebra com sensibilidade aprimorada.

Podemos monitorar a função sináptica provocada pela estimulação moderada, que não foi testada anteriormente. Este protocolo de imagem pode ser realizado sob um microscópio de epifluorescência convencional e não requer necessariamente um microscópio confocal de varredura a laser. Em outras palavras, este método fornece uma plataforma econômica para imagens da função neuromuscular em comparação com outras configurações experimentais.

Para preparar 200 mililitros da solução extracelular, misture 6,4 mililitros de cloreto de sódio 3,5 molar, 0,4 mililitros de cloreto de potássio molar, 1 mililitro de HEPES molar, 0,4 mililitros de cloreto de cálcio molar, 0,2 mililitros de cloreto de magnésio molar e 360 miligramas de glicose. Em seguida, adicione água ultrapura para elevar o volume total para 200 mililitros. Adicione 20 microlitros de solução estoque de D-tubocurarina de 15 milimolares para preparar 100 mililitros de solução extracelular com D-tubocurarina 3 micromolar.

Para preparar 25 mililitros da solução extracelular contendo 0,02% de tricaína, adicione 0,5 mililitros de solução estoque de tricaína a 25% Usando um extrator de micropipeta, puxe os capilares de vidro até que o diâmetro da ponta meça dentro da faixa de 3 a 10 micrômetros. Encha a pipeta com a solução extracelular.

Insira um fio fino de platina em cada abertura do capilar e segure o eletrodo de pipeta de vidro no suporte da pipeta do micromanipulador motorizado. Em seguida, conecte o back-end de cada fio ao isolador de estímulo. Para 25 mililitros de solução extracelular contendo 0,02% de tricaína em uma placa de Petri de vidro, transfira uma larva de peixe-zebra para a placa de Petri para dissecação.

Use duas pinças finas para descascar a pele das larvas. Use a primeira pinça para manter as larvas no lugar e aperte a pele do lado dorsal da bexiga natatória com a outra pinça. Em seguida, usando bisturi, remova a bexiga natatória, os órgãos internos e a cabeça.

Use uma pipeta de pasteur de vidro com uma ponta polida a fogo para transferir a amostra de peixe-zebra dissecada para a câmara de imagem. Fixe mecanicamente a amostra com um fio de náilon colado a um fio de platina em forma de C para orientá-la em um ângulo aproximadamente paralelo ao eletrodo de estimulação. Perfundir a amostra utilizando um sistema de fluxo por gravidade a uma taxa de 1 mililitro por minuto com uma solução extracelular contendo 3 micromolares de D-tubocurarina.

Em seguida, insira o eletrodo de estimulação na medula espinhal. Posicione cuidadosamente a ponta do eletrodo perto dos neurônios motores espinhais, identificados como neurônios positivos para TagRFP localizados no lado ventral da medula espinhal. Avance o eletrodo em um ângulo oblíquo do segmento adjacente até a posição alvo.

Para começar em um computador, selecione a região de imagem com base na imagem ao vivo da fluorescência TagRFP. Certifique-se de que a região selecionada inclua vários botões e exclua aqueles próximos ao limite do segmento do corpo. Troque a unidade de filtro de fluorescência GFP fluorescência de flúor para geração de imagens.

Em seguida, ajuste a intensidade da fonte de luz para obter uma imagem brilhante no modo de lapso de tempo de 1 hertz sem saturação. Insira o tempo de exposição para 100 no campo milissegundos de exposição da janela do microgerenciador. Configure o software de aquisição de imagem e o dispositivo de entrada e saída digital para sincronizar a aquisição de imagem com a estimulação elétrica.

Em seguida, determine a frequência de estimulação, o número de potenciais de ação e o atraso de tempo entre o início da aquisição da imagem e a entrega da estimulação no script Arduino. Com base nessas configurações, calcule o número total de imagens necessárias para aquisição e insira esse valor no campo de contagem da janela de aquisição multidimensional no micromanager. Defina um intervalo de 1 segundo no campo de intervalo para imagens de lapso de tempo de 1 hertz.

Para estimulação elétrica, configure o isolador de estímulo para fornecer pulsos de tensão constante de 1 milissegundo de 70 milivolts. Execute o comando digitalizador para iniciar a aquisição da imagem. Monitore o processo para verificar se não há desvio de imagem inaceitável e se o flúor e as respostas são observáveis.

Modifique a intensidade da estimulação, como frequência em número de pulsos, ou ajuste a temperatura com base no propósito experimental. Salve as imagens de lapso de tempo como uma pilha de séries temporais TIFF. Sinapses com grandes aumentos de sinal foram selecionadas para análise, embora todos os botões tenham mostrado alterações detectáveis na condição de potencial de ação de 20 hertz 100, Respostas robustas de flúor foram observadas após estimulação elétrica de alta frequência com alterações de fluorescência indicando exocitose durante a estimulação e subsequente decaimento, refletindo endocitose e reacidificação de vesículas sinápticas.

As constantes de tempo de decaimento de fluorescência variaram com estímulo, intensidade e temperatura com 20 hertz 25 potenciais de ação mostrando 16,6 segundos, 20 hertz 100 potenciais de ação em 56,8 segundos e 50 hertz 500 potenciais de ação em 62,7 segundos.