Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

Estudei o impacto da exposição aguda ao estrogênio no metabolismo central do carbono plaquetário e nas plaquetas ativadas por trombina e repouso. Estamos tentando determinar se a exposição aguda ao estrogênio nas plaquetas contribui para o aumento do risco trombótico transmitido pelo uso de contraceptivos orais. A pesquisa em saúde da mulher é amplamente subfinanciada.

Este projeto fez parte de um apelo maior do NIH para abordar as lacunas no conhecimento sobre a saúde da mulher. Apesar de os anticoncepcionais estarem disponíveis há mais de 50 anos, ainda não sabemos o mecanismo exato que resulta em maior risco trombótico. Variabilidade biológica.

As técnicas tradicionais de cultura de células não se aplicam às plaquetas, o que significa que as plaquetas vêm de doadores com genótipos diferentes. São necessários grandes tamanhos de amostra, enfatizando a necessidade de um procedimento de isolamento plaquetário repetível. Os protocolos de lavagem de plaquetas existentes são escritos para especialistas no campo da biologia plaquetária.

Há uma série de desafios únicos associados ao trabalho com plaquetas que meu protocolo destaca para o pesquisador iniciante de plaquetas. Para começar, pré-aqueça o banho-maria a 37 graus Celsius e coloque o tampão de Tyrode modificado contendo glicose nele. Combine o sangue total coletado de todos os vacutainers em um tubo cônico de polipropileno de 50 mililitros.

Usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado, pegue um volume de amostra apropriado para realizar uma contagem de células. Aspire cuidadosamente com uma pipeta de transferência de orifício estreito para remover quaisquer bolhas geradas. Em seguida, deixe o sangue descansar em banho-maria a 37 graus Celsius por 25 minutos.

Para evitar a ativação durante a centrifugação, adicione prostaglandina I2 e apirase ao sangue total e inverta o tubo uma vez para misturar a amostra. Em seguida, centrifugue todo o sangue a 250G por 15 minutos sem interrupção a 37 graus Celsius. Colete o PRP, que aparece como a camada amarela superior acima da camada leucocitária e da camada de sangue vermelho, em um novo tubo cônico inclinado de 50 mililitros ao longo da parede.

Deixe o PRP descansar por 10 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, misture o PRP com 500 prostaglandinas I2 nanomolares e 0,02 unidades por mililitro de apirase. Centrifugue a mistura a 1.000 G por 10 minutos a 37 graus Celsius sem aceleração e sem interrupção.

Agora, usando uma pipeta de transferência de plástico de diâmetro largo, aspire o sobrenadante para o volume a granel e, em seguida, use uma pipeta de um mililitro com uma ponta não cortada para aspirar o líquido restante perto do pellet. Em seguida, adicione a prostaglandina I2 e o tampão de Tyrode contendo apirase ao pellet, ao lado do tubo cônico. Usando uma ponta de corte chanfrado e uma ponta de pipeta de um mililitro, ressuspenda suavemente o pellet várias vezes.

Assim que o pellet for ressuspenso, use uma pipeta de transferência de furo largo para transferi-lo para um novo tubo cônico, deixando para trás quaisquer glóbulos vermelhos ou células visivelmente aglomeradas. Em seguida, colher uma amostra para citometria de fluxo usando uma ponta de pipeta de corte chanfrado. Incube o restante das plaquetas por uma hora a 37 graus Celsius para permitir que os inibidores se desgastem.

Após a incubação, misture suavemente a amostra com uma pipeta de furo largo e alíquota das amostras para citometria de fluxo. A recuperação média de plaquetas do sangue total foi de cerca de 52%, com a contaminação dos glóbulos brancos permanecendo abaixo de 0,1% após o processo de lavagem. A exposição à p-selectina foi baixa durante todo o processo de lavagem, mas aumentou significativamente após o tratamento com trombina.

Os níveis de fibrinogênio ligado inicialmente aumentaram após a primeira centrifugação de 1.000G, mas caíram abaixo de 5% após a segunda centrifugação, aumentando novamente significativamente após o tratamento com trombina. As plaquetas foram fechadas com sucesso para tamanho, singletos e positividade de CD42a antes de medir os marcadores de ativação. O tratamento com trombina levou a um aumento significativo na expressão de P-selectina e fibrinogênio em comparação com o controle.

Para começar, obtenha as plaquetas lavadas a partir de amostras de sangue humano. Após o pré-resfriamento da microcentrífuga a zero graus Celsius, colete a suspensão plaquetária em solução salina normal parcialmente congelada na proporção de 1:6. Centrifugue a mistura a 16.000 G por 10 minutos a zero graus Celsius.

Aspirar o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga separado. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de metanol pré-resfriado: água a menos 20 graus Celsius ao pellet temperado e vórtice vigorosamente por um minuto. Congele a amostra em nitrogênio líquido e descongele a zero graus Celsius.

Centrifugar novamente a suspensão a 16 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius e recolher o sobrenadante num novo tubo de microcentrífuga. Depois de secar o sobrenadante durante a noite, ressuspenda o extrato seco em 150 microlitros de água de grau LC/MS e misture por 15 minutos a quatro graus Celsius. Um breve vórtice e transfira o extrato para um tubo de microcentrífuga de 0,22 micrômetro para remover os detritos celulares.

Centrifugue a amostra por cinco minutos a 16.000G e quatro graus Celsius. Após a centrifugação, pipete mais 50 microlitros de água no filtro e centrifugue novamente por cinco minutos a 16.000G e quatro graus Celsius. Por fim, recolher o filtrado para análise.

A produção de lactato foi positiva em todas as amostras de doadores, enquanto a glicose e o acetato foram consumidos de forma consistente, com a trombina aumentando esses fluxos.