Avaliação da fagocitose microglial de detritos de mielina in vitro sob estimulação magnética repetida

[Instrutor] O escopo do nosso estudo se concentra na pesquisa em neuro-reabilitação e terapia de simulação magnética. Este protocolo pode fornecer novas ideias para a estimulação magnética ao explorar como ela afeta uma função clara. Vamos nos concentrar na neurorreabilitação e na terapia de estimulação magnética no futuro.

[Instrutor] Para começar, obtenha uma cabeça decapitada de um rato fêmea. Disseque a cabeça no gelo. Com uma tesoura, divida o crânio ao meio para expor totalmente o cérebro e facilitar sua remoção completa. Use tesouras e fórceps para extirpar meticulosa e assepticamente as membranas, o cerebelo e o hipocampo. Limpe o cérebro três vezes com PBS para remover qualquer sangue ou tecido residual. Transfira o cérebro limpo para 10 mililitros de solução de sacarose estéril 0,32 molar. Com uma tesoura microcirúrgica, corte o tecido cerebral em pedaços para obter uma mistura de tecido cerebral e sacarose. Em seguida, transfira a mistura de tecido cerebral e sacarose para um homogeneizador estéril de 50 mililitros. Adicione 30 mililitros de solução de sacarose estéril 0,32 molar. Use um homogeneizador de vidro de 50 mililitros para moer o tecido por dois minutos. Para obter um homogeneizado de tecido cerebral liso. Dilua o homogeneizado do tecido cerebral a 90 mililitros com solução de sacarose estéril 0,32 molar e misture bem. Adicione 20 mililitros de solução de sacarose estéril 0,83 molar em seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estéreis e de paredes finas. Em seguida, dispense lentamente 15 mililitros da mistura cerebral na parte superior dos tubos. Nivele os volumes com solução de sacarose estéril 0,32 molar. Para coletar os detritos brutos de mielina, primeiro pré-resfrie e ultra centrifugue o rotor a quatro graus Celsius. Centrifugue a amostra a 75.000 G por 45 minutos e, em seguida, colete os detritos de mielina da interface entre as duas densidades de sacarose usando uma pipeta de pastagem estéril. Para a primeira separação e purificação isotônica, transfira a solução de detritos de mielina coletada para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Ajuste o volume para 35 mililitros com PBS estéril pré-resfriado e transfira para um novo tubo homogeneizador. Após homogeneizar por três minutos, distribuir uniformemente o homogeneizado de detritos de mielina em seis tubos de ultracentrífuga de polipropileno estéreis de 38,5 mililitros, de paredes finas. Completar o volume com PBS estéril e centrifugar. Para a segunda separação e purificação isotônica, ressuspenda o pellet branco sólido em 10 mililitros de PBS estéril pré-resfriado para obter uma suspensão de detritos de mielina. Distribua a suspensão em tubos de ultracentrífuga como antes e centrifugue. Após centrifugação, rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet branco sólido em seis mililitros de PBS estéril. Divida a suspensão de detritos de mielina em seis tubos de centrífuga de 1,5 e centrifugue novamente. Finalmente, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de PBS estéril pré-resfriado após descartar o sobrenadante. Descongele os detritos de mielina necessários a quatro graus Celsius, ou em água gelada, e centrifugue como antes por 10 minutos. Ressuspenda os detritos de mielina em 200 microlitros de solução CFSE 50 micromolar. Incubar a suspensão à temperatura ambiente no escuro durante 30 minutos e depois centrifugar novamente. Descarte o sobrenadante e lave as amostras três vezes com 500 microlitros de PBS estéril. Ressuspenda os detritos de mielina em 100 microlitros de PBS estéril pré-resfriado para obter uma suspensão de detritos de mielina marcados com fluorescência. Armazene a amostra a -80 graus Celsius até uso posterior. Para estimulação magnética repetida in vitro, defina a frequência do tratamento para 20 hertz, a intensidade do tratamento para 1% da intensidade máxima de saída e o tempo de estimulação para cinco segundos. Inclua um período de descanso de 20 segundos e administre 600 pulsos em um único tempo de tratamento de 2,5 minutos. Depois de predeterminar os parâmetros de estimulação magnética, fixe a direção da bobina perpendicularmente ao solo e oriente-a para cima. Esterilize a bobina de estimulação magnética com álcool para evitar a contaminação celular. Depois de adicionar 50 micromolares de CFSE, coloque 1.000 células BV-2 em placas de 24 poços durante a noite, aspire o meio antigo com uma pipeta e adicione imediatamente o meio fresco sem soro. Mude o meio para meio sem soro e trate as células com um micrograma por mililitro de lipopolissacarídeo por 12 horas. Após 12 horas de intervenção com lipopolissacarídeos, adicione 100 microgramas por mililitro de detritos de mielina ao meio para co-cultura no escuro. Sujeite as células a estimulação magnética repetida, conforme demonstrado anteriormente. Borrife álcool sobre a placa para esterilizá-la antes de devolvê-la à incubadora. Após um período de co-cultura com fragmentos de mielina, lave suavemente os detritos de mielina não absorvidos com PBS. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 15 minutos. Em seguida, adicione 150 microlitros de PBS contendo 10% de albumina de soro de burro e 0,3% de Triton X-100 aos poços e incuba. Depois de lavar os poços com PBS, adicione uma solução de anticorpos primários na proporção de 100 a 200 nos poços e incube no frio. Em seguida, incube as células em um anticorpo secundário na proporção de 100 a 300 por duas horas em temperatura ambiente antes de obter imagens com um microscópio confocal. As células da microglia BV-2 exibiram uma redução significativa na fagocitose de detritos de mielina após o tratamento com lipopolissacarídeos. que foi revertida após intervenção repetida de estimulação magnética. A análise quantitativa confirmou uma diminuição significativa na área de detritos de mielina dentro das células BV-2 no grupo lipopolissacarídeo em comparação com o controle, com um aumento notável no grupo estimulado magneticamente tratado com lipopolissacarídeo. A porcentagem de micróglia positiva para IBA-1 co-localizada com detritos de mielina foi significativamente menor no grupo LPS em comparação com o controle, enquanto a estimulação magnética aumentou significativamente essa porcentagem. Um aumento dependente do tempo na fagocitose microglial foi observado com o grupo estimulado magneticamente tratado com lipopolissacarídeo para o nosso grupo mostrando captação significativamente maior de detritos de mielina.