Crioseccionamento e imunocoloração do tecido do ouvido interno de camundongos: dos estágios embrionário ao adulto

Minha pesquisa se concentra no neurodesenvolvimento da cóclea. Especificamente, pretendo descobrir os mecanismos subjacentes da formação de SNAPS dentro da cóclea e investigar a conexão entre a doença de Alzheimer e a perda auditiva. As ferramentas genéticas e de imagem ao vivo estão melhorando nossa capacidade de estudar estruturas cocleares e circuitos neurais com mais detalhes, fornecendo insights mais profundos sobre a resiliência e disfunção do sistema auditivo. Ao publicar este protocolo, queremos ajudar os pesquisadores que são novos na ciência do auditor, especialmente aqueles que nunca trabalharam com cóclea antes. Este guia explica passo a passo como preparar amostras do ouvido interno de camundongos embrionários, recém-nascidos e adultos. Nosso objetivo é facilitar os experimentos com o ouvido interno e garantir que os resultados sejam confiáveis e consistentes. A imunocoloração de seção transversal tem várias vantagens sobre outros métodos, como a imunocoloração de montagem total. Ele preserva bem as proteínas e os ácidos nucléicos e cria seções finas e quase 2D, o que torna as medições mais precisas e consistentes. Este método também mantém todos os tipos de células cocleares intactos e visíveis, melhorando o culto da imunocoloração. Ao contrário das preparações de montagem inteira, o corte transversal preserva estruturas importantes, como o ligamento espiral, estria vascular, membrana de Reissner e membrana tectória.

[Instrutor] Para começar, coloque o camundongo juvenil sacrificado em uma plataforma cirúrgica. Usando uma tesoura de dissecção fina, faça cuidadosamente uma incisão na linha média ao longo do couro cabeludo, começando do pescoço e estendendo-se em direção ao focinho. Em seguida, coloque a lâmina inferior da tesoura no forame magno e a lâmina superior no crânio. Corte a metade superior do crânio até o nariz para completar o segundo corte. Retire a tesoura da cabeça parcialmente incisada. Coloque a lâmina inferior da tesoura na parte inferior do crânio e a lâmina superior no forame magno. Corte a metade inferior da cabeça até o nariz para completar o terceiro corte. Usando pinças finas e tesouras, retire cuidadosamente qualquer tecido mole ao redor do osso temporal, incluindo o cérebro, músculos e tecido conjuntivo. Em seguida, coloque as meias cabeças do rato em poços de uma placa de 24 poços contendo PBS. Substitua o PBS por uma solução de paraformaldeído a 4% para fixação e incube por 45 minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, enxágue o tecido três vezes por cinco a 10 minutos com PBS. Localize o osso temporal ou a cápsula do ouvido interno dentro da meia cabeça do camundongo. Usando uma pinça fina, retire cuidadosamente o tecido mole ao redor da cápsula do ouvido interno. Uma vez solto, corte o tecido ao redor da cápsula interna do ouvido. Em seguida, aplique uma leve pressão na área ao redor da cápsula do ouvido interno usando uma pinça para liberá-la completamente. Armazene as amostras do ouvido interno em PBS a quatro graus Celsius. Para começar, coloque o camundongo adulto sacrificado em uma plataforma cirúrgica. Usando uma tesoura de dissecção afiada, faça uma incisão na linha média ao longo do couro cabeludo, começando do pescoço e estendendo-se em direção ao focinho. Dobre a pele para trás para expor o crânio durante o primeiro corte. Coloque a lâmina inferior da tesoura no forame magno e a lâmina superior no crânio. Corte a metade superior do crânio até o nariz para completar o segundo corte. Retire a tesoura da cabeça parcialmente incisada. Posicione a lâmina inferior na base do crânio e a lâmina superior no forame magno. Corte a metade inferior da cabeça até o nariz ao longo da linha média, evitando as orelhas internas. Para cada meia cabeça, use uma pinça e uma tesoura para separar o tecido mole ao redor do osso temporal, incluindo o cérebro, os músculos e o tecido conjuntivo. Em seguida, enrole o tecido do crânio com os dedos e use o polegar para aplicar uma leve pressão na parte inferior do osso temporal. Gradualmente, afrouxe o osso de suas inserções circundantes. Depois que a cápsula do ouvido interno for removida, enxágue-a abundantemente com PBS. Coloque um prato Sylgard cheio de paraformaldeído a 4% sob o microscópio. Posicione uma única cápsula do ouvido interno no prato. Examine o ouvido interno em busca de qualquer tecido mole ou osso preso e remova-o com cuidado. Identifique a janela oval e remova suavemente o estribo usando uma pinça. Em seguida, usando uma pinça fina, abra um pequeno orifício no ápice da cóclea. Usando uma pipeta P20 cheia de paraformaldeído a 4%, lave a cóclea para garantir que fluidos, como sangue diluído ou endolinfa, saiam pela janela oval. Transfira a cóclea fixa para uma placa de 24 poços preenchida com paraformaldeído a 4%. Marque o tempo e incube por 30 a 60 minutos com agitação suave usando um balancim ou nutator. Após a incubação, enxágue a amostra três vezes por cinco a 10 minutos com PBS. Após o enxágue final, coloque a cóclea em EDTA 1,25 milimolar e deixe-a balançar por dois a três dias a quatro graus Celsius. Após o tratamento com EDTA, enxágue a cóclea três vezes por cinco minutos com PBS. Para começar, coloque a cápsula dissecada do ouvido interno em solução de sacarose a 10% e incube em temperatura ambiente por duas horas. Após a incubação, substitua a solução de sacarose a 10% por sacarose a 20% e incube por mais duas horas. Em seguida, substitua a solução de sacarose a 20% por sacarose a 30% e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, remova metade da solução de sacarose a 30%. Preencha o espaço com temperatura de corte ideal ou composto OCT e deixe a amostra balançar por 30 minutos a duas horas. Transfira as amostras para criomoldes rotulados preenchidos com composto OCT. Verifique a orientação da cóclea no criobloco embutido. Garantir o ouvido interno; O lado côncavo está voltado para os lados estreitos do criomolde para seções transversais cocleares padrão. Em seguida, coloque gelo seco em um pequeno recipiente e adicione cinco a 10 mililitros de dimetilbutano. Coloque os criomoldes contendo OCT e a amostra no gelo seco borbulhante para congelar rapidamente o bloco. Transferir os crioblocos para a câmara de um criostato pré-arrefecido a 20 graus Celsius negativos. Deixar as amostras equilibrarem durante 30 a 60 minutos. Usando um lápis ou caneta, marque o lado do criobloco correspondente à posição coclear para garantir a orientação adequada para o seccionamento. Em seguida, adicione uma pequena poça de OCT ao mandril e coloque o bloco criogênico sobre ele, garantindo que o lado largo sem a marca do lápis esteja voltado para baixo. Colocar o manípulo que contém a OCT e a amostra na câmara de criostato refrigerada, deixando a OCT congelar completamente. Após alguns minutos, posicione o mandril com a amostra no suporte do mandril com a marca de lápis apontando para a direita ou para a esquerda. Em um criostato, apare o bloco usando uma configuração de 40 micrômetros até que o tecido se torne aparente. Assim que o tecido estiver aparente, colha uma seção de 12 micrômetros usando lâminas projetadas para criossecção. Verifique a localização da seção sob um microscópio. Se se aproximar de voltas cocleares, continue colhendo seções de 12 micrômetros, verificando periodicamente a posição até que todas as voltas cocleares tenham sido seccionadas.