Isolamento de populações de células mieloides e epiteliais vivas do pulmão de camundongo

Estudamos o reparo pulmonar após infecção viral. Nosso objetivo é entender os mecanismos pelos quais as células imunes medeiam o reparo epitelial e como a remodelação após lesão viral e reparo subsequente pode afetar futuras patologias de doenças. Este protocolo aborda a incompatibilidade de digestões pulmonares otimizadas para células epiteliais e estromais ou células imunes.

Nossa pesquisa requer o isolamento de células viáveis de compartimentos imunológicos e não imunológicos. Além disso, apresentamos uma estratégia de gating para subconjuntos epiteliais e de macrófagos, que esperamos que beneficie o campo. Nosso laboratório investiga a interferência entre células imunes e epiteliais no trato respiratório em condições de estado estacionário e em resposta a desafios ambientais.

Nosso objetivo final é determinar a melhor forma de modular essa comunicação para melhorar o reparo tecidual e prevenir o desenvolvimento de doenças. Para começar, borrife o mouse com 70% de etanol. Usando uma tesoura cirúrgica fina e uma pinça número sete, faça uma incisão no abdômen e corte lateralmente o peritônio.

Faça um pequeno corte no diafragma para liberar o vácuo. Em seguida, corte o diafragma e a caixa torácica inferior da cavidade corporal para expor os pulmões e o coração. Usando uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 27, perfunda os pulmões com cinco mililitros de EDTA de dois milimolares em DPBS.

Corte verticalmente através do esterno e ao longo dos lados para abrir a caixa torácica e expor a traqueia. Use uma tesoura fina e uma pinça número sete para remover o máximo possível de músculo e tecido conjuntivo sem perfurar a traqueia ou os pulmões. Em seguida, enrole a traqueia com uma sutura 2/0, posicionando-a como se fosse amarrá-la, mas não aperte.

Faça um corte lateral na traqueia e insira o cateter. Em seguida, puxe a sutura firmemente para prender o cateter no lugar. Infle os pulmões com um mililitro de DPBS usando uma seringa.

Em seguida, puxe lentamente a seringa para retirar o DPBS. Volte a inflar os pulmões com a mesma sapb e, novamente, puxe a seringa para coletar o fluido de lavagem broncoalveolar, ou LBA. Desconecte a seringa do cateter enquanto deixa o cateter inserido.

Dispense a válvula coletada em um tubo de microcentrífuga. Em seguida, encha a mesma seringa de um mililitro com um mililitro de dispase. Conecte a seringa ao cateter e encha os pulmões com dispase.

Ao remover o cateter, aperte a sutura ao redor da traqueia para evitar vazamento de dispersão. Usando uma tesoura, corte lateralmente através da traqueia. Remova os pulmões da cavidade corporal cortando o tecido conjuntivo ao longo da parte de trás da caixa torácica enquanto puxa os pulmões e a traqueia para cima.

Em seguida, remova o coração dos pulmões. Coloque os pulmões em cinco mililitros de DPBS no gelo. Válvula de centrífuga a 400 G por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Com uma pipeta, aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 100 microlitros de RPMI. Para começar, disseque os cinco lobos dos pulmões colhidos do camundongo e descarte o tecido conjuntivo. Pique o tecido pulmonar dissecado com uma tesoura por um minuto em uma lâmina de vidro.

Usando uma tesoura de dissecação, transfira o tecido pulmonar picado para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Em seguida, adicione três mililitros de mistura de digestão e pipete a mistura de digestão pulmonar para cima e para baixo duas a três vezes. Por fim, adicione o pellet celular recuperado do LBA ressuspenso em RPMI.

Coloque o tubo em um ângulo de 45 graus em um agitador orbital ajustado para 140 RPM a 37 graus Celsius por 40 minutos. Após a incubação, retire o tubo do shaker e coloque-o no gelo. Pipete a mistura de digestão pulmonar para cima e para baixo cinco a seis vezes.

Filtrar a mistura através de um filtro de células de 70 micrómetros para um novo tubo de 50 mililitros. Lave as células restantes através do filtro e neutralize as enzimas com 10 mililitros de 5% FBS no meio RPMI. Centrifugar a amostra a 600 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius.

Aspirar o sobrenadante utilizando um aspirador de vácuo. Ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de lise ACK e incube por três minutos em temperatura ambiente para lisar os glóbulos vermelhos. Em seguida, adicione nove mililitros de PBS e pipete para cima e para baixo para misturar a solução.

Novamente, centrifugue a amostra e use um aspirador a vácuo para remover o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de tampão de classificação de células ativado por fluorescência. Filtrar a suspensão através de uma malha de 64 micrómetros num tubo de microcentrífuga para análise por citometria de fluxo.