Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Nossa pesquisa investigou a linhagem de monócitos e macrófagos, enfatizando sua notável plasticidade e capacidade de integrar vários sinais do ambiente para moldar a resposta efetora durante a inflamação, reparo tecidual e infecções. Os macrófagos são encontrados em todo o corpo e coordenam o início e a resolução da imunidade inata e adaptada, impactando a patologia protegida e imunomediada. A reprogramação de macrófagos é a característica mais promissora neste campo.

A tecnologia ômica emergente revolucionou nossa compreensão da biologia dos macrófagos, fornecendo informações sobre sua diversidade fenotípica, a característica funcional, seu potencial de programação e a origem do desenvolvimento dessas células. O principal obstáculo e armadilha na descoberta da diferenciação e polarização de macrófagos são as condições e protocolos experimentais heterogêneos em toda a literatura e a falta de consenso na definição do termo macrófago. Demonstramos o efeito de reprogramação do medicamento e do mediador lipídico na polarização de macrófagos e desenvolvemos um modelo 3D in vitro de interação entre células de macrófagos e glioblastoma.

Além disso, mostramos que as plaquetas licenciam a diferenciação de macrófagos derivados de monócitos para o fenótipo N1. Para começar, coloque amostras de sangue periférico anticoagulado em uma centrífuga. Gire para 200G por 15 minutos em temperatura ambiente.

Observe a separação do plasma rico em plaquetas na parte superior e a fração celular, incluindo glóbulos vermelhos e brancos, abaixo. Diluir a fracção celular obtida na primeira centrifugação com PBS estéril pré-aquecido à temperatura ambiente. Homogeneizar suavemente a solução antes de proceder à centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Hypaque.

Transfira 15 mililitros de Ficoll-Hypaque para um tubo estéril de 15 mililitros. Adicione cuidadosa e lentamente 30 mililitros de sangue diluído em cima do Ficoll, garantindo uma mistura mínima entre as fases. Centrifugue o tubo contendo o Ficoll e o sangue diluído a 600G por 25 minutos em temperatura ambiente.

Com uma pipeta Pasteur estéril de três mililitros, remova um pouco da camada superior amarela. Recolha cuidadosamente a interface entre a camada amarela e a camada Ficoll com uma pipeta Pasteur estéril. Transfira as células mononucleares do sangue periférico coletadas, ou PBMCs, para um novo tubo de 15 mililitros contendo pelo menos três mililitros de PBS estéril.

Complete o tubo com PBS estéril para atingir um volume total de 12 a 15 mililitros. Em seguida, centrifugue a amostra a 600G por 10 minutos. Em seguida, gire a suspensão PBMC a 300G por cinco minutos a 8 a 10 graus Celsius.

Ressuspenda as células no volume desejado de PBS frio estéril com 2% de FBS. Mantenha as células a 4 graus Celsius até a próxima etapa. Transfira o volume desejado de suspensão PBMC para um tubo de fundo redondo de poliestireno de cinco mililitros.

Em seguida, adicione 10 microlitros de coquetel de seleção positiva para cada 100 microlitros de suspensão celular. Misture bem a suspensão antes de incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, pipete 10 microlitros de nanopartículas magnéticas por 100 microlitros de suspensão celular.

Pipetar vigorosamente para cima e para baixo mais de cinco vezes para garantir uma suspensão uniforme das nanopartículas magnéticas. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, adicione PBS contendo FBS e EDTA à suspensão para perfazer o volume total de 2,5 mililitros. Pipete suavemente as células para cima e para baixo duas a três vezes.

Insira o tubo no classificador magnético e deixe-o repousar por cinco minutos. Inverta o ímã junto com o tubo em um movimento contínuo. Mantenha o ímã e o tubo invertidos por dois a três segundos antes de retorná-los à posição vertical.

Remova o tubo do ímã e, em seguida, adicione 2,5 mililitros de tampão PBS-FBS-EDTA no tubo novamente. Pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo duas a três vezes para misturá-la. Insira o tubo de volta no ímã e separe-o por cinco minutos.

Em um movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo novamente, descartando a fração sobrenadante. Remova o tubo do ímã e ressuspenda as células em um volume apropriado de PBS-FBS sem EDTA. As células selecionadas positivamente estão agora prontas para uso.

Agora adicione o tampão PBS-FBS às células CD14 classificadas, perfazendo o volume total de 12 a 14 mililitros para diluir qualquer EDTA restante. Centrifugue a 600G por 10 minutos. Depois de descartar o sobrenadante, ressuspenda os monócitos CD14 selecionados positivamente em dois mililitros de tampão PBS-FBS.

Conte as células usando um contador automático de células. Mantenha as células no gelo até a preparação da cultura. Para cultura, ressuspenda o pellet a uma concentração de um milhão de células por mililitro em meio RPMI 1640 suplementado.

Pipete 250 microlitros da suspensão de células preparadas em cada poço de uma placa de 48 poços. Adicione 250 microlitros de meio RPMI suplementado com antibiótico contendo 50 nanogramas por mililitro de fator estimulador de colônias de macrófagos em cada poço. Incube a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada para iniciar a diferenciação de macrófagos.

No quarto dia de diferenciação de macrófagos, substitua metade do meio de cultura de cada poço. Adicione citocinas ou reagentes para as condições de polarização desejadas e continue cultivando por mais três dias. Colha os monócitos derivados de macrófagos no sétimo dia para caracterização fenotípica.

Os macrófagos M1 induzidos por interferon gama-mais lipopolissacarídeo exibiram a maior expressão de CD64, ausência de CD206 e baixos níveis de CD163 e MERTK. Os macrófagos M2a induzidos pela interleucina 4 foram caracterizados pelo aumento da expressão de CD206 e redução dos níveis de CD64, CD163 e MERTK. Macrófagos M2c induzidos por interleucina 10 ou dexametasona exibiram aumento da expressão de CD163 e CD14, níveis intermediários de CD64 e aumento na expressão de MERTK.