Name: Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a reprogramar macrófagos derivados de monócitos humanos para estudos de imunologia e biologia celular. Este modelo in vitro padronizado revela a plasticidade celular e resposta a estímulos.

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Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Promoção da Ciência e Tecnologia (ANPCyT-FONCYT) por meio das bolsas PICT 2018-3070 e 2021-I-A-00807 para E.A.C.S. e PICT 2021-I-A-00716 para AEE, e pelo Conselho Nacional de Pesquisas Científicas e Técnicas (CONICET) por meio da bolsa PIP 2022-0763 e pela Universidade de Buenos Aires por meio de Projetos de Investigação e Desenvolvimento em Áreas Estratégicas com Impacto Social (PIDAE) 2022 para A.E.E., E.A.C.S. e A.E.E. são investigadores de carreira no CONICET.

Todos os doadores de sangue voluntários saudáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional da Academia Nacional de Medicina (IMEX-CONICET-ANM) Argentina. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.
1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
NOTA: As PBMCs são isoladas de 40 mL de sangue periférico anticoagulado com citrato de sódio a 3,8% e usando centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (1077). Este protocolo é realizado em condições estéreis em um gabinete de biossegurança BSL2.
<ol>
	<li>Transfira a amostra de sangue periférico anticoagulado recebida para tubos apropriados de 15 mL ou 50 mL para centrifugação.</li>
	<li>Centrifugue amostras de sangue a 200 × g por 15 min (aceleração: 4 desaceleração: 2, quando o máximo é 5) à temperatura ambiente para obter plasma rico em plaquetas (PRP) na parte superior e fração celular, incluindo glóbulos vermelhos e brancos abaixo. Consulte Figura 1.</li>
	<li>Transferir a fração superior (PRP) para tubos de 15 ml (se for armazenado plasma) e centrifugar a 600 × g durante 10 min (aceleração e desaceleração máximas) para obter a fração plasmática final sem plaquetas. Armazenar o plasma a -20 °C.</li>
	<li>Diluir a fração celular obtida na primeira centrifugação, 2x (mínimo) a 3x (máximo) usando solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (1x PBS) pré-aquecida à temperatura ambiente. Homogeneizar suavemente e utilizar esta fracção diluída para a centrifugação do gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque.</li>
	<li>Transfira 15 mL de Ficoll-Hypaque para um tubo estéril de 50 mL. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente 30 mL de sangue diluído em cima do Ficoll, evitando misturar as fases. Se estiver trabalhando com 10 mL ou menos de sangue diluído, transfira 4 mL de Ficoll-Hypaque para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione os 10 mL de amostra de sangue diluído. 
	NOTA: Esta etapa é crítica para obter a fração mononuclear.</li>
	<li>Centrifugar o tubo que contém o Ficoll mais sangue diluído a 600 × g durante 25 min (aceleração: 1; Desaceleração: 0) à temperatura ambiente.</li>
	<li>Remova um pouco da camada superior amarela com uma pipeta Pasteur estéril de 3 mL. Em seguida, colete cuidadosamente a interface (fração mononuclear do "anel") formada entre a camada superior amarela e a camada Ficoll com uma pipeta Pasteur estéril. Este "anel" contém as células mononucleares (PBMC) de interesse. 
	NOTA: Parte da fase plasmática restante pode ser coletada, mas certifique-se de evitar a fase Ficoll, pois pode ser tóxica para os PBMCs.</li>
	<li>Transfira os PBMCs coletados para um novo tubo de 15 mL contendo um mínimo de 3 mL de PBS 1x estéril. Em seguida, complete com o volume correspondente de 1x PBS estéril para 12-15 mL. Centrifugar os PBMCs a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.</li>
	<li>Rejeitar o sobrenadante e lavar novamente os PBMC. Ressuspenda o pellet celular adicionando 1 mL de 1x PBS estéril e, em seguida, complete até 12-14 mL com 1x PBS estéril adicional. Centrifugar os tubos a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet PBMC em 1x PBS estéril contendo 2% de soro fetal bovino inativado (1x PBS-2% FBS) e aumente o volume para 10 mL. Use um contador automático de células ou conte as células, preparando uma suspensão de células 1:5 diluída em frio estéril 1x PBS e depois (1:2) em Trypan Blue para obter uma diluição final de 1:10. Use um microscópio óptico para contar.</li>
	<li>Gire a suspensão PBMC a 300 × g por 5 min a 8-10 ° C. Ressuspenda as células em um volume desejado de 1x PBS-2% FBS estéril e frio para obter uma concentração final de 108 células / mL. Deixe essas células a 4 °C até a próxima etapa. 
	NOTA: Se os PBMCs coletados não forem usados no mesmo dia, recomenda-se congelar em um frasco criogênico a 108 células / mL em meio de congelamento apropriado (90% de FBS contendo 10% de dimetilsulfóxido, DMSO). Armazene a -80 °C em um recipiente de polietilenoglicol durante a noite para permitir que as células congelem lentamente, minimizando assim os danos celulares. No dia seguinte, transfira as células para uma caixa de armazenamento e deixe-as a -80 °C por alguns dias ou transfira para um tanque de nitrogênio líquido por um longo período de armazenamento.</li>
</ol>
2. Classificação de monócitos CD14+ usando esferas magnéticas
NOTA: A quantidade de monócitos CD14 encontrados em PBMCs de doadores saudáveis é variável dependendo da idade e sexo. Quando disponível, use um contador de células para obter a % de monócitos em cada amostra e, em seguida, calcule o número de PBMCs necessários para classificar os monócitos CD14 necessários. Se nenhum contador de células estiver disponível, 10% de monócitos por amostra PBMC pode ser considerado uma abordagem ampla4,6,7,10,11,12,13.
Os monócitos CD14+ são isolados usando um kit de seleção positiva CD14 humana5. Padronizamos o protocolo de isolamento usando 1 a 2 × 107 PBMCs em 100 μL de reação; Use essa proporção para números mais altos. O volume mínimo de reação sugerido é de 100 μL, mesmo com um número de células inferior a 1 × 107 PBMCs.
<ol>
	<li>Prepare a suspensão de células PBMC na concentração de 1-2 × 108 células/mL em 1x PBS-2% FBS contendo 1 mM de tampão de ácido etilenodiaminotetracético (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) e transfira a quantidade desejada de PBMCs para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL.</li>
	<li>Adicione 10 μL de Coquetel de Seleção Positiva para cada 100 μL de suspensão celular, misture bem e incube em temperatura ambiente por 15 min.</li>
	<li>Adicione 10 μL de nanopartículas magnéticas por 100 μL de suspensão celular, pipete vigorosamente para cima e para baixo mais de 5x para suspender uniformemente as nanopartículas magnéticas e incube em temperatura ambiente por 10 min. 
	NOTA: O vórtice não é recomendado.</li>
	<li>Adicione 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tampão para aumentar o volume total da suspensão celular para 2,5 mL. Pipete suavemente as células do tubo para cima e para baixo 2-3x. Insira o tubo no classificador magnético e separe-o por 5 min.</li>
	<li>Pegue o ímã e inverta-o e o tubo em um movimento contínuo, descartando a fração sobrenadante. As células marcadas magneticamente permanecerão dentro do tubo. Deixe o ímã e o tubo invertidos por 2-3 s e, em seguida, gire-os verticalmente na vertical. 
	NOTA: Deixe todas as gotas penduradas na boca do tubo; não os agite ou seque.</li>
	<li>Remova o tubo do ímã e adicione 2.5 mL de 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tampão no tubo novamente. Pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo 2-3x para misturá-la. Insira o tubo de volta no ímã e separe-o por 5 min.</li>
	<li>Em um movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo, descartando a fração sobrenadante. Remova o tubo do ímã e ressuspenda as células em uma quantidade adequada de 1x tampão PBS-2% FBS (sem EDTA). As células selecionadas positivamente agora estão prontas para uso. 
	NOTA: Um total de duas separações de 5 minutos são necessárias no ímã.</li>
	<li>Lave as células CD14 classificadas empregando 1x tampão PBS-2% FBS, trazendo a suspensão celular para 12-14 mL para diluir qualquer EDTA restante e, em seguida, centrifugue a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) por 10 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e repita a lavagem ressuspendendo o pellet celular com 1 mL de 1x tampão PBS-2% FBS primeiro e depois completando o volume para 12-14 mL. Centrifugar os tubos a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.</li>
	<li>Descarte o sobrenadante e ressuspenda os monócitos CD14 selecionados positivos em 2 mL de tampão PBS-2% FBS 1x. Use o contador automático de células ou conte as células diluindo a suspensão celular (1:5) em frio estéril 1x PBS e depois (1:2) em Trypan Blue usando um microscópio óptico. Deixe as células no gelo até o preparo da cultura. 
	NOTA: A pureza celular pode ser testada por citometria de fluxo, pegando 50 μL da suspensão celular e colorando-a para células CD14+ (clone HCD14). Recomenda-se mais de 90% de pureza.</li>
	<li>Para cultura, gire a suspensão celular a 300 × g por 5 min a 8-10 ° C. Ressuspenda o pellet na concentração de 106 células / mL usando RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inativado e 1% de penicilina-estreptomicina (RPMI-10% FBS-1% P / S). 
	NOTA: É fundamental usar um FBS de alta qualidade, com baixo teor de endotoxinas e inativado pelo calor. Mantenha sempre no gelo para evitar a aderência dos monócitos à parede de plástico antes de revestir.</li>
</ol>
3. Diferenciação e polarização de macrófagos derivados de monócitos (M-DM)
NOTA: A cultura M-DM é realizada por plaqueamento de 2,5 × 105 monócitos CD14+ em placas de 48 poços contendo 500 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S e cultivado em uma incubadora umidificada a 37 °C com CO2 (5%) por 7 dias. Escolha placas tratadas para aumentar a aderência dos monócitos à placa.
<ol>
	<li>Defina todas as condições experimentais a serem executadas, incluindo poços para M-DM basal (M0), o M1 inflamatório, o reparo tecidual M2a, o M2c regulador e as condições de teste desejadas.</li>
	<li>Pipetar 250 μL da suspensão celular preparada na etapa 2.11 para semear 2,5 ×10 5 monócitos CD14+ em cada poço.</li>
	<li>Adicione 250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S mais 50 ng/mL de M-CSF a cada poço para completar os 500 μL de volume total.</li>
	<li>Incubar a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 4 dias para permitir a primeira etapa da diferenciação de macrófagos. 
	NOTA: Verifique periodicamente a diferenciação da cultura de células para ver se ocorreram alterações morfológicas conforme o esperado ou se existem células indesejadas não anexadas.</li>
	<li>Substitua metade do meio de cultura (250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S) no dia 4 da cultura M-DM. Adicione citocinas ou reagentes para as condições polarizantes e cultive-os por 3 dias (o ponto final é o dia 7): LPS (1 ng/mL) mais IFNγ (50 ng/mL) para M1, IL-4 (40 ng/mL) para M2a, IL-10 (50 ng/mL) ou dexametasona (0,1 μM) para M2c.</li>
	<li>Colha M-DM no dia 7 para realizar a caracterização fenotípica, colete-os para expressão de mRNA conforme indicado nas próximas duas etapas ou realize um ensaio funcional.</li>
</ol>
4. Caracterização do fenótipo de superfície em M-DM polarizado por citometria de fluxo
<ol>
	<li>Descarte o volume total do meio de cultura (500 μL de uma placa de 48 poços) e adicione 200 μL de 1x tampão PBS-2% FBS-1 mM EDTA para coleta de células. Incube por 20 min no gelo e, em seguida, adicione 200 μL de 1x PBS-2% FBS para diluir o tampão EDTA. Colete o M-DM pipetando para cima e para baixo em microtubos de 1,5 mL. Lave essas células colhidas uma vez com 1x PBS-2% FBS e centrifugue a 800 × g por 3 min.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet M-DM com 200 μL de PBS-5% FBS 1x e transfira-os para uma microplaca de fundo redondo de 96 poços para bloqueio à temperatura ambiente por 15 min. Centrifugue as células a 800 × g por 3 min.</li>
	<li>Prepare a combinação apropriada de anticorpos diretamente conjugados em 1x PBS- 2% FBS. Manchar cada alvéolo ou condição (1x) com 50 μL do painel de anticorpos e incubar a 4 °C durante 30 min no escuro. 
	NOTA: Aqui, o painel de anticorpos consistiu em CD11b-APC / Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP / Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 e MERTK-biotina mais estreptavidina-PE. A concentração de anticorpos titulados está listada na Tabela 1.</li>
	<li>Lave o M-DM corado adicionando 150 μL de 1x PBS e centrifugue a 800 × g por 3 min.</li>
	<li>Para medir a viabilidade celular, adicione 100 μL do corante de viabilidade fixável Zombie Violet (1:1.000 em 1x PBS) e incube a 4 °C por 30 min no escuro.</li>
	<li>Lave as células coradas adicionando 100 μL de 1x PBS e centrifugue a 800 × g por 3 min. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS.</li>
	<li>Fixe ressuspendendo o pellet M-DM com 100 μL do reagente fixador (do kit fixador/permeabilização) e incubando-os por 20 min no gelo e no escuro. 
	NOTA: Para obter a fixação adequada, é essencial homogeneizar o pellet celular corretamente.</li>
	<li>Lave o M-DM adicionando 100 μL de 1x PBS-2% FBS e centrifugue a 800 × g por 3 min. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS-2% FBS.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet M-DM em 200 μL de 1x PBS e execute as células coradas no citômetro de fluxo.</li>
</ol>
5. Perfil do programa genético para discriminar a polarização M-DM por qPCR
NOTA: No dia 7 da cultura, 2,5 ×10 5 M-DM podem ser colhidos usando o reagente de extração de RNA para o isolamento de RNA total de alta qualidade. O isolamento de RNA também pode ser realizado usando métodos alternativos, como extração de RNA baseada em coluna e um kit de eluição.
<ol>
	<li>Rejeitar o volume total do meio de cultura e o M-DM lisado adicionando directamente 350 μL do reagente de extracção. Homogeneizar e transferir esta suspensão celular para um microtubo livre de RNase / DNase de 1,5 mL e continuar com o isolamento de RNA. 
	NOTA: Se o isolamento de RNA não for realizado no mesmo dia, a amostra da etapa 5.1 pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite ou -20 ° C por até um ano.</li>
	<li>Para permitir a dissociação completa do complexo de nucleoproteínas, incubar as amostras homogeneizadas da etapa 5.1 durante 5 min a 25 °C</li>
	<li>Adicionar 70 μL de clorofórmio a cada amostra. Tampe bem cada tubo para evitar vazamentos e misture bem o conteúdo agitando o tubo. Incubar as amostras durante 2-3 min e, em seguida, centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. Esta etapa separará totalmente as fases em uma fase inferior de fenol-clorofórmio, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor. 
	NOTA: O volume de clorofórmio é baseado em uma proporção de 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de reagente de extração usado durante a etapa de lise.</li>
	<li>Transferir a fase aquosa contendo o RNA para um novo microtubo livre de RNase/DNase de 1,5 mL. 
	NOTA: Deixe para trás um pequeno volume ao tomar a fase aquosa para evitar a transferência de qualquer uma das camadas interfásicas ou orgânicas.</li>
	<li>Adicione 175 μL de isopropanol a cada amostra para precipitar o RNA. Incubar por 10 min a 4 °C ou, alternativamente, durante a noite a -20 °C. 
	NOTA: O volume de isopropanol é baseado em uma proporção de 0,5 mL de isopropanol por mL de reagente de extração inicial.</li>
	<li>Centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Um pellet branco semelhante a um gel de RNA total precipitará no fundo do tubo. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta.</li>
	<li>Lave o RNA ressuspendendo o pellet branco em forma de gel em 350 μL de etanol a 75% (1 mL por 1 mL de reagente de extração (v / v) usado para lise). 
	NOTA: O RNA pode ser armazenado em etanol a 75% por até 1 ano a -20 °C ou até 1 semana a 4 °C.</li>
	<li>Agitar brevemente o sedimento ressuspenso e centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. Retirar e eliminar o sobrenadante com uma micropipeta. Seque ao ar ou aspire o pellet de RNA por 5-10 min. 
	NOTA: Para solubilizar o RNA, evite o ressecamento do pellet de RNA.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 20-30 μL de água livre de RNase pipetando para cima e para baixo. Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 55-60 °C durante 10-15 min. Prossiga para medir a concentração de RNA e armazene o RNA a -70 °C.</li>
	<li>Realize a transcrição reversa (cópia de cDNA) usando 100-500 ng de RNA (mínimo e máximo, respectivamente) em 20 μL de volume de reação, empregando um kit de síntese de cDNA.</li>
	<li>Execute as reações de PCR em tempo real usando 1 μL de cDNA (5-25 ng).
	<ol>
		<li>Prepare a mistura de reação para cada tubo (1x) usando 5 μL de mistura verde SYBR (2x), 0,2 μL de cada primer (direto e reverso) e 3,6 μL de água livre de nuclease. Dimensione todos os componentes de acordo com o número da amostra. Misture bem a mistura de reação e dispense 9 μL em cada tubo de qPCR e, finalmente, 1 μL de cDNA para atingir o volume total final de 10 μL.</li>
		<li>Programe o protocolo de ciclagem térmica em um instrumento de PCR em tempo real da seguinte forma: 2-3 min a 98 °C (1x); 5-15 s a 98 °C mais 15-30 s a 60 °C (35-40x); por fim, inclua a análise da curva de fusão (65-95 °C) com incremento de 0,5 °C a 2-5 s/passo ou use a configuração padrão do instrumento. 
		NOTA: Esta reação foi padronizada empregando a mistura universal SYBR Green. Os primers recomendados para análise de polarização M-DM estão listados na Tabela 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Normalizar os resultados utilizando como gene de referência o fator de alongamento da tradução eucariótica 1 alfa 1 (EEF1A1), e verificar a especificidade dos produtos amplificados através da análise das curvas de dissociação. 
	NOTA: A análise da curva de dissociação permite confirmar a presença de apenas um produto de amplificação de qPCR na reação.</li>
</ol>

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<li>Laplante, M., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+signaling+in+growth+control+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR signaling in growth control and disease.</a> Cell. 149 (2), 274-293 (2012).</li>
<li>Covarrubias, A. J., Aksoylar, H. I., Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+macrophage+metabolism+and+activation+by+mTOR+and+Akt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Control of macrophage metabolism and activation by mTOR and Akt signaling.</a> Semin Immunol. 27 (4), 286-296 (2015).</li>
<li>Shahbazian, D., Parsyan, A., Petroulakis, E., Hershey, J., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eif4b+controls+survival+and+proliferation+and+is+regulated+by+proto-oncogenic+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Eif4b controls survival and proliferation and is regulated by proto-oncogenic signaling pathways.</a> Cell Cycle. 9 (20), 4106-4109 (2010).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

A diferenciação, ativação e polarização de macrófagos tornaram-se um foco central na imunologia, homeostase tecidual, patogênese da doença e resolução da inflamação. Além disso, a imagem emergente de que os macrófagos teciduais podem ser derivados de monócitos circulantes sob condições de homeostase interrompida enfatiza a necessidade de modelos M-DM precisos caracterizados por fenótipos definidos, programas transcricionais e vias de ativação.
Algumas etapas críticas deste protocolo devem ser ...

Os macrófagos, identificados pela primeira vez por Metchnikoff por sua capacidade fagocítica, são células antigas fundamentais para a vida dos metazoários. Encontrados de forma ubíqua em mamíferos adultos, eles exibem notável diversidade anatômica e funcional. Como parte do sistema fagocítico mononuclear, ao lado das células dendríticas e monócitos, os macrófagos desempenham papéis cruciais em vários processos biológicos, desde o desenvolvimento e homeostase até as respostas imunes contra patógenos1,2. Macrófagos residentes, especializados em seus microambientes teciduais, atuam como sentinelas, monitorando a saúde dos tecidos e respondendo a mudanças fisiológicas e ameaças externas. Acredita-se que sua plasticidade limitada seja uma adaptação evolutiva para manter a homeostase do tecido. Em contraste, os monócitos recrutados são mais flexíveis e podem se diferenciar em diversos fenótipos de macrófagos durante a inflamação. Essa dupla influência da inflamação e do nicho tecidual molda a diversidade funcional dos macrófagos3. Assim, dependendo do meio tecidual local, os macrófagos derivados de monócitos (M-DM) podem se diferenciar em muitos subtipos. Os metabólitos locais, fatores de crescimento, citocinas e interação célula-célula4,5,6 descrevem seus fenótipos e funções. Além disso, os macrófagos são os principais produtores de fatores que amortecem a inflamação e impulsionam a revascularização e o reparo tecidual7,8.
Dado que pelo menos três braços principais controlam a polarização (condições extrínsecas, intrínsecas e de ambiente tecidual), a polarização de macrófagos deve ser vista como multidimensional2. Os principais obstáculos e armadilhas na descrição da diferenciação e polarização de macrófagos são as condições experimentais heterogêneas em toda a literatura e a falta de consenso na definição de termos de macrófagos em experimentos in vitro e in vivo9. No entanto, alguma unificação de padrões experimentais começou para diversos cenários experimentais.
Para entender melhor o campo de macrófagos humanos, precisamos de modelos in vitro padronizados e bem definidos de M-DM para ligação, diferenciação, polarização, fenótipo e reprogramação, bem como funções específicas. Nosso objetivo foi definir um modelo in vitro padronizado de M-DM M0 humano não polarizado e macrófagos polarizados por citocinas para estudar a reprogramação enviesada de M-DM por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Embora a polarização de macrófagos seja um processo dinâmico devido à sua alta plasticidade e capacidade de integrar múltiplos sinais de seu ambiente, caracterizamos aqui o M-DM não polarizado (M0) e alguns estados de polarização in vitro, como o pró-inflamatório clássico, comumente reconhecido também como M1, induzido com IFNγ e LPS. Da mesma forma, o reparo tecidual e os macrófagos M2 reguladores podem ser definidos como M2a quando induzidos com IL-4 e M2c quando estimulados com dexametasona ou IL-10. Esses estados polarizadores capturam um instantâneo do amplo espectro do meio M-DM no tempo e no espaço, mas nos dão alguns pontos cardeais para definir o mapa analítico onde localizar as condições de teste.
Apesar da combinação complexa e dinâmica de marcadores de superfície e programas transcricionais, ao analisar in vitro o M-DM, estabelecemos que CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK podem separar a condição M0 não polarizada de M1 induzida por IFNγ/LPS, M2a induzida por IL-4 e IL-10 ou induzida por dexametasona por citometria de fluxo. Além disso, a expressão dos genes IRF1 e CXCL10 foi definida como específica para M1 induzida por IFNγ / LPS; Transcritos específicos de IRF4, CCL22 e TGM2 para M2a derivado de IL-4; e gene MERTK para M2c derivado de dexametasona, estabelecendo pontos cardeais adicionais para comparar a reprogramação distorcida de M-DM desafiada com diferentes estímulos ou mesmo co-cultivada com outros tipos de células.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 mouse anti-humano&nbsp; CD206 Clone de anticorpo 15-2</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 321113; RRID: AB_571874</td><td></td></tr><tr><td>APC camundongo anti-humano CD64 Anticorpo clone 10.1</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 305013; RRID: AB_1595539</td><td></td></tr><tr><td>APC / Cy7 rato anti-camundongo / clone de anticorpo CD11b humano M1 / 70</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 101226; RRID:AB_830642</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA, EUA</td><td>Cat# 554714</td><td>kit de fixação/permeabilização</td></tr><tr><td>Biotina anti-humano MERTK Anticorpo clone 590H11G1E3</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 367616; RRID:AB_2721500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Equipamento CFX-Connect&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de Seleção Positiva CD14 Humano EasySep; Coquetel de Seleção Positiva EasySep; Nanopartículas magnéticas EasySep; Easy Sep Magnet</td><td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá</td><td>Cat# 18058</td><td></td></tr><tr><td>FACS Citômetro Canto&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nova Jersey, EUA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino, qualificado, Nova Zelândia&nbsp;</td><td>Gibco&trade; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA EUA&nbsp;</td><td>Cat# 10091148</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS Cytiva</td><td>GE Healthcare - Ciências da Vida, EUA</td><td>Cat# 17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC.</td><td>RRID:SCR_008520</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism&nbsp; &nbsp;</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>RRID:SCR_002798</td><td></td></tr><tr><td>kit de síntese de cDNA iScript, inclui mistura de reação de transcrição reversa 5x, transcriptase reversa iScript, água livre de nuclease</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, EUA</td><td>Cat# 1708891</td><td></td></tr><tr><td>Partec CyFlow citômetro espacial&nbsp;</td><td>Sysmex Partec, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Streptavidin</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Cat# 405203</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 camundongo anti-humano CD14 Anticorpo clone HCD14 BioLegend</td><td>, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 325618; RRID: AB_830691</td><td></td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 clone de anticorpo CD163 humano GHI / 61</td><td>BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato# 333607; RRID:AB_1134006</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Médio Gibco</td><td>&trade; &nbsp; Thermo Fisher Scientific Waltham, MA EUA&nbsp;</td><td>Cat# 11875119</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, contém fusi&oacute Sso7d de arranque a quente mediado por anticorpos; n polimerase, dNTPs, MgCl2, corante SYBR Green I, intensificadores, estabilizadores e uma mistura de corantes de referência passivos (incluindo ROX e fluoresceína).</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td><td>Cat# 1725271</td><td></td></tr><tr><td>TriZol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific Life Sciences Solutions Carlsbad, CA, USA&nbsp;</td><td>Cat#&nbsp; 15596026</td><td>Reagente de extração de RNA</td></tr><tr><td>Zombie Violet Fixable Kit</td><td>de Viabilidade BioLegend, San Diego, CA, EUA.</td><td>Gato # 423113</td><td></td></tr></tbody></table>

modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

As células da linhagem monócitos-macrófagos são multifuncionais e encontradas em quase todos os tecidos do corpo. Eles coordenam as fases de iniciação e resolução da imunidade inata e adaptativa, afetando significativamente a imunidade protetora e a lesão patológica imunomediada. Embora os macrófagos residentes no tecido sejam atores-chave na manutenção da homeostase em estado estacionário, grandes quantidades de monócitos são recrutadas do sangue periférico para o tecido após danos ou insultos inflamatórios. Os macrófagos derivados de monócitos (M-DM) podem se diferenciar em muitos subtipos dinâmicos, e seus fenótipos e funções dependem do ambiente tecidual local. 
Para comparar diferentes estímulos ou condições ambientais durante a diferenciação e polarização do M-DM, padronizamos um modelo in vitro de M-DM M0 humano não polarizado e alguns macrófagos polarizados por citocinas cardinais, M1 derivado de IFNγ/LPS, M2a derivado de IL-4 e M2c derivado de IL-10 ou dexametasona, para analisar a reprogramação enviesada de M-DM por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Descobrimos que CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK podem discriminar claramente M0 não polarizado e M1, M2a e M2c polarizados por citometria de fluxo. Além disso, definimos IRF1 e CXCL10 como genes específicos para transcritos específicos clássicos de M1, IRF4, CCL22 e TGM2 derivados de IFNγ / LPS para M2a derivado de IL-4 e o gene MERTK para M2c derivado de dexametasona. Para resumir, nosso protocolo M-DM padronizado pode fornecer o mapa cardinal in vitro para analisar a diferenciação e polarização do M-DM humano sob diversos estímulos.

Com base em nosso trabalho de caracterização de macrófagos ao longo de vários anos, definimos uma combinação precisa de marcadores que distingue claramente os diferentes subconjuntos de M-DM in-vitro. Os marcadores fenotípicos foram selecionados com base na literatura e em uma ampla triagem prévia que havíamos realizado anteriormente9,14,15,16,17. Alé...

Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

Cells of the monocyte-macrophage lineage are multifunctional and found in almost all body tissues. They coordinate innate and adaptive immunity&#180;s ...

reprograming-model-human-monocyte-derived-macrophages-for-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de eferocitose para estudar a depuração de células apoptóticas usando microscopia confocal. A eferocitose é um processo de várias etapas em que as células apoptóticas são engolidas por fagócitos e degradadas dentro de vesículas chamadas eferrossomos. Este protocolo fornece um método para visualizar porções internalizadas e não internalizadas de células apoptóticas individuais e quantificar a eferocitose.

Ensaio de Eferocitose de Células Fixas: Um Método para Estudar a Captação Eferocítica de Células Apoptóticas por Macrófagos Usando Microscopia de Fluorescência

Este vídeo demonstra o priming de monócitos primários em macrófagos. Os monócitos humanos primários podem ser isolados e diferenciados para um fenótipo pró-inflamatório semelhante ao M1 usando o fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) ou para um fenótipo anti-inflamatório semelhante ao M2 usando o fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF).

Cultura in vitro e diferenciação de monócitos primários em macrófagos

Este vídeo demonstra a ativação de proteínas caspase em macrófagos humanos usando proteínas repórter de complementação de fluorescência bimolecular. Os pró-domínios da caspase-1 são fundidos com fragmentos não fluorescentes de proteínas de Vênus, que são recrutados para complexos inflamassomas. A proximidade dos inflamassomas induz o redobramento e fluorescência dos fragmentos de Vênus, confirmando a ativação da caspase nos macrófagos.

Visualização da ativação de caspase em macrófagos derivados de monócitos humanos

Macrófagos derivados de monócitos são importantes células do sistema imune inato. Aqui, descrevemos um fácil de...

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Apresenta-se um protocolo simples e eficiente para a geração de macrófagos humanos. Casacos de Buffy são processados ​​por dupla centrifugação em gradiente de densidade e monócitos isolados são então diferenciado para macrófagos em revestidos de teflon de cultura de células de sacas. Isso maximiza o rendimento de macrófagos e facilita a colheita de células para experiências posteriores.

Isolamento de monócitos humanos por duas vezes centrifugação em gradiente e sua diferenciação de macrófagos em revestidos de teflon Cultura de Células Bags

Um protocolo é apresentado para cultura de células de macrófagos derivados de monócitos humanos diferenciados pelo fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF). O protocolo utiliza a criopreservação de monócitos juntamente com sua diferenciação em massa em macrófagos. Em seguida, os macrófagos colhidos podem ser semeados em poços de cultura nas densidades celulares necessárias para a realização de experimentos.

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

Apresentado aqui é um protocolo para detectar a produção de armadilha extracelular de macrófagos (MET) na cultura celular ao vivo usando microscopia e mancha de fluorescência. Este protocolo pode ser estendido para examinar marcadores específicos da proteína met por coloração de imunofluorescência.

Estimulação e visualização in vitro da liberação extracelular da armadilha em macrófagos humanos monocyte-derivados diferenciados

Este protocolo descreve a geração robusta de macrófagos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, e métodos para sua caracterização subseqüente. A expressão do marcador de superfície celular, a expressão genética e os ensaios funcionais são usados para avaliar o fenótipo e a função desses macrófagos derivados do iPSC.

Produção e Caracterização de Macrófagos Humanos de Células-Tronco Pluripotentes

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para avaliar o potencial imunomodulador das superfícies de implantes in vitro, visando melhorar a confiabilidade e reprodutibilidade dos protocolos atuais e promover novas pesquisas. Perfis de citocinas secretoras, expressão de mRNA e marcadores de superfície celular foram monitorados usando macrófagos derivados de monócitos sanguíneos para investigar a polarização de macrófagos cultivados em titânio.

Polarização e caracterização de macrófagos derivados de monócitos humanos M1 e M2 em superfícies de implantes 

Dados os modelos limitados de xenoenxerto disponíveis para estudar as interações entre CART humano e células mieloides, estabelecemos modelos in vitro e in vivo para entender os impactos dos macrófagos humanos nas células CART. Os resultados podem ser potencialmente generalizados para avaliar os papéis dos macrófagos no microambiente tumoral e testar imunoterapias direcionadas a macrófagos.

Estudando interações entre células mieloides e células T CAR in vitro e in vivo

Aprenda a reprogramar macrófagos derivados de monócitos humanos para estudos de imunologia e biologia celular. Este modelo in vitro padronizado revela a plasticidade celular e resposta a estímulos.

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

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