Name: Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-14T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprenda a avaliar a citotoxicidade de células T CAR em nível de célula única usando encapsulação em gotículas de dupla emulsão. Este método permite analisar a diversidade funcional e atividade citotóxica individual com precisão superior aos ensaios em massa.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blocker BSA (BSA)</td><td>Thermo Scientific</td><td>37525</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Kit de Proliferação de Células Vermelhas Distantes (corante fluorescente vermelho distante)</td><td>Invitrogen</td><td>C34564</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Proliferação de Células Violetas CellTrace (corante fluorescente violeta)</td>Solução Estabilizadora <td>Invitrogen</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>DE ( solução estabilizadora)</td><td>Samplix</td><td>REDIVSTABSOL1500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (dPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (dPBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>PBS-1A</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator (grânulos de ativação CD3/CD28)</td><td>Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Concentrator (reagente à base de PEG)</td><td>Takara Bio</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>MACSelect LNGFR Microbeads (contas magnéticas anti-NGFR)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-330</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep densidade gradiente médio (gradiente médio)</td> <td>Célula-tronco</td><td>7820</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P / S)</td> <td>Capricorn Scientific</td><td>PS-B</td><td></td></tr><tr><td>Iodeto de propídio (PI)</td> <td>Invitrogen</td><td>BMS500PI</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 humano recombinante (IL-2)</td> <td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 com glutamina estável ( RPMI-1640)</td><td>Capricorn Scientific</td><td>RPMI-STA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 sem L-Glutamina e vermelho de fenol</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE óleo I (óleo)</td><td>Substrato Samplix</td><td>REOILDEC1900</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop Granzyme B (substrato GzmB)</td><td>Corante</td> de viabilidade <td>Samplix REGRB100</td><td></td></tr><tr><td>Zombie-NIR (corante de viabilidade)</td><td>BioLegend</td><td>423106</td><td></td></tr><tr><td><forte>Plasticware etc.</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 câmaras lâmina de vidro</td><td>Chemometec</td><td>942-0003</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células, 12 poços</td><td>TH Geyer</td><td>7696791</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind tubo, 2 mL (tubo de DNA)</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>tubo Eppendorf, 1,5 mL (tubo de 1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubo, 15 mL ( Tubo de 15 mL)</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Falcon, 5 mL (tubo de 5 mL)</td><td>Falcon (VWR)</td><td>734-0443</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de suspensão de células verdes para incubações de células (frasco T75)</td><td>Sarstedt</td><td>148.19.22</td><td></td></tr><tr><td>Placas de suspensão de células verdes para incubações de células (placa de 96 poços)</td><td>Sarstedt</td><td>148.32.20</td><td></td></tr><tr><td>LS Colunas de separação (coluna de separação)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE Juntas (juntas)</td><td>Samplix</td><td>#GADEA100</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop DE50 Cartucho (cartucho de encapsulamento)</td><td>Samplix</td><td>#CADE50A100</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-CCR7 PE-Dazzle 594</td><td>BioLegend</td><td>353236</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD19 CAR FMC63 Idiotype Antibody, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-127-342</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 APC</td><td>Biolegend</td><td>300439</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 BV480</td><td>BD Biosciences</td><td>566105</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 BUV661</td><td>BD Biosciences</td><td>612962</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD4 StarBright Violet 760</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1267SBV760T</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45RA BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>740298</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>344712</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 StarBright Violet</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1226SBV760</td><td></td></tr><tr><td>anti-NGFR FITC</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td>anti-NGFR PE</td><td>BioLegend</td><td>345106</td><td></td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr> Linha celular de <tr><td>linfoma de células do manto JeKo-1 (JeKo-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3006</td><td></td></tr><tr><td>Células mononucleares primárias do sangue periférico (PBMCs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Contador de Células Automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo NovoCyte Quanteon (citômetro de fluxo)</td><td>Agilent</td><td>2010011AA</td><td></td></tr><tr><td>Xdrop (dispositivo microfluídico)</td><td>Samplix</td><td>IN00110-EU</td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células t receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Droplet-based Cytotoxicity Assay to Assess Chimeric Antigen Receptor T cells at the Single-cell Level

Após a transdução, as células T foram analisadas quanto à expressão de CAR por citometria de fluxo usando anticorpos anti-CD3 e anti-NGFR. A população de células T CAR foi posteriormente enriquecida usando esferas magnéticas anti-NGFR, resultando em uma pureza de mais de 98% para ambos os doadores (Figura 1A-B). A relação CD4/CD8 e o fenótipo de memória das células CAR classificadas usadas também foram quantificados, usando uma estratégia de porta padrão utilizando anticorpos CCR7 e CD45RA. Esses dados mostram que a proporção CD4 / CD8 das células T CAR usadas foi de 0,73, e as células eram principalmente de fenótipo de memória ingênuo (Figura 1C-E).
As células T CAR e as células JeKo-1 foram coradas com corantes violeta e vermelho-distante, respectivamente, e encapsuladas em gotículas DE50 juntamente com os reagentes de ensaio substrato GzmB e PI (Figura 2). Alternativamente, as células T CAR também podem ser marcadas usando anticorpos como anti-CD4 ou anti-CD8 (Figura 3), permitindo uma caracterização mais detalhada das células T. Cada suspensão de células T (CAR T ou NTD) foi misturada com uma suspensão de células JeKo-1 imediatamente antes do encapsulamento em uma proporção efetor: célula-alvo de 1:3 (0,5 x 106 células T e 1,5 x 106 JeKo-1). Após o encapsulamento, cada produção de gotículas (células T CAR + JeKo-1 e NTD + JeKo-1) foi dividida em três tubos de incubação por 2 h, 4 h e 6 h de incubação, respectivamente. As células foram incubadas dentro das gotículas a 37 °C em CO2 a 5% e, em seguida, analisadas por microscopia e citometria de fluxo nos momentos indicados.
Realizamos microscopia de fluorescência de gotículas de dupla emulsão após 4 h de incubação (Figura 4). A intensidade do sinal de fluorescência verde (FITC) ilustra o nível de atividade secretada de GzmB de células T CAR ou NTDs dentro das gotículas DE50. A Figura 4B apresenta imagens de contraste de fase e microscopia de fluorescência de uma única gotícula positiva para GzmB contendo uma célula CAR T e uma célula-alvo JeKo-1 em contato próximo.
Em seguida, as gotículas de DE50 foram analisadas por citometria de fluxo para quantificar a porcentagem de células T CAR com secreção precoce de GzmB e atividade de morte de células citotóxicas (Figura 5). A coloração pré-incubação de células-alvo JeKo-1 com um corante vermelho distante e células T efetoras com um corante violeta antes do encapsulamento facilitou a identificação de três populações distintas de gotículas contendo células, pois as células são distribuídas em gotículas com base na distribuição de Poisson. As populações de gotículas identificadas são gotículas apenas com células T, células JeKo-1 sozinhas e células T e células JeKo-1 juntas (Figura 5A). Células T co-encapsuladas por gotículas com células JeKo-1 foram fechadas e analisadas quanto a sinais que indicam atividade de GzmB (Figura 5B) e morte celular, conforme indicado por PI (Figura 5C).
O encapsulamento de células em gotículas segue a distribuição de Poisson, e quatro populações de gotículas diferentes são obtidas (Figura 6A). A Figura 6B mostra o nível de gotículas positivas para GzmB em todas as populações de gotículas após 6 h de incubação de gotículas, a partir das quais a porcentagem de células T secretoras espontâneas de GzmB pode ser determinada. Esses dados indicam a alta especificidade do método, pois apenas as células T CAR secretam GzmB.
Finalmente, quantificamos os níveis de GzmB e PI em pontos de tempo, após 2 h, 4 h e 6 h de co-incubação. Para referência, as gotículas contendo apenas células T e apenas células JeKo-1 foram analisadas para examinar a morte celular de fundo em cada população (Figura 6C). A morte celular de fundo foi usada para determinar a porcentagem de células T vivas secretoras de GzmB e matadoras de células-alvo na população de células efetoras (Figura 7), conforme descrito na etapa 3.3. As células CAR T de dois doadores exibiram um aumento dependente do tempo na secreção de GzmB induzida pela célula-alvo e na atividade de morte celular. Quase 36% das células T CAR vivas do Doador 1 e 31% do Doador 2 secretaram GzmB após 6 h de co-encapsulamento com a célula-alvo, um aumento significativo em comparação com as células T de controle NTD (Figura 7A). Da mesma forma, cerca de 21% das células T CAR vivas do Doador 1 e 22% das células CAR T vivas do Doador 2 mataram células-alvo, conforme indicado por um sinal PI positivo (Figura 7B). A porcentagem de células T CAR que secretaram GzmB excedeu a porcentagem de células-alvo mortas em cada ponto de tempo, consistente com a sequência esperada de eventos na citotoxicidade mediada por GzmB. Em conjunto, esses dados mostram que o método aqui apresentado permite a caracterização da heterogeneidade na citotoxicidade de células T individuais dentro de uma população de células, bem como comparações entre diferentes populações.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig01.jpg"> 
Figura 1: Gráficos de citometria de fluxo representativos após a classificação NGFR. (A) Após aproximadamente 10 dias de expansão, as células T CAR foram classificadas usando microesferas específicas para NGFR e classificação magnética, resultando em uma população de células T CAR que era &gt;98% de células T CAR. (B) Quantificação de células T CAR de dois doadores usados neste estudo antes e depois da triagem. (C) Estratégia de bloqueio usada para examinar a relação CD4 / CD8 e o fenótipo de memória das células T. (D) Quantificação de CD4 e CD8 de células T utilizadas. (E) Quantificação do fenótipo de memória das células T utilizadas. Abreviatura: CM = memória central, EM = memória efetora, NTD = não transduzida, TEMRA = células efetoras terminalmente diferenciadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig02.jpg"> 
Figura 2: Fluxo de trabalho para o ensaio combinado de secreção e citotoxicidade de GzmB com resolução de célula única em gotículas. Antes do encapsulamento em gotículas DE, as células-alvo e efetoras são coradas separadamente usando coragens de células violetas e vermelhas distantes. Usando o dispositivo microfluídico e o cartucho de encapsulamento, as células efetoras são co-encapsuladas com células-alvo em gotículas junto com meio celular, PI e substrato peptídico GzmB marcado com FAM. O ensaio e a incubação ocorrem dentro das gotículas. A atividade secretada de GzmB é indicada pela emissão de fluorescência verde que ocorre após a clivagem do substrato de GzmB. A morte celular é indicada por PI. Após a incubação, as gotículas de DE50 são analisadas por microscopia e/ou citometria de fluxo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig03.jpg"> 
Figura 3: Análise de PBMCs encapsuladas em gotículas pré-marcadas com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD8. (A) Imagens de microscopia de gotículas com PBMCs encapsuladas pré-marcadas com anticorpos anti-CD3 (APC) e anti-CD4 (NIR). Barra de escala = 100 μm. (B) Como (A), mas com marcação CD3 (FITC) e anti-CD8 (NIR). Barra de escala = 100 μm. (C) Análise por citometria de fluxo das mesmas gotículas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig04.jpg"> 
Figura 4: Imagens microscópicas de gotículas com células efetoras e alvo. As imagens foram tiradas após 4 h de incubação em uma incubadora de células umidificadas padrão de 37 °C, 5% de CO2 . (A) Gotículas de uma amostra com células NTD e JeKo-1 encapsuladas (esquerda) ou células CAR T e células JeKo-1 (direita) fotografadas por microscopia de fluorescência usando o canal FITC para detectar gotículas GzmB positivas (verde). Barra de escala = 500 μm. (B) Uma única gotícula fotografada por contraste de fase, FITC (GzmB), APC (célula JeKo-1) e DAPI (célula T CAR). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig05.jpg"> 
Figura 5: Estratégia de gating para análise de gotículas por citometria de fluxo após a incubação. (A) O gating foi feito por dispersão direta e lateral para identificar gotículas, seguido pela seleção da porta contendo as gotículas. Os eventos fora do portão representam gotículas de óleo produzidas como subproduto da produção de gotículas de emulsão dupla. A análise de fluorescência subsequente de gotículas em canais correspondentes às colorações celulares aplicadas identifica quatro populações de gotículas: gotículas contendo células T e células JeKo-1 (quadrado vermelho); gotículas apenas com células JeKo-1; gotículas apenas com células T; e gotículas vazias. (B) Histogramas representativos para o sinal GzmB em gotículas duplamente positivas em pontos de tempo e entre células NTD e CAR T. (C) Histogramas representativos para o sinal PI em gotículas duplamente positivas em pontos de tempo e entre células T NTD e CAR. Todas as medições de gotículas são realizadas como medições de altura de intensidade (H). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig06.jpg"> 
Figura 6: Controle interno e populações de referência. (A) Cada um dos quatro quadrantes da Figura 5A foi selecionado, e GzmB e PI foram medidos em cada um. Esse tipo de quantificação permite que os sinais de fundo sejam medidos e subtraídos antes que uma análise final da eficácia das células T seja realizada. (B) Gráfico mostrando a frequência de gotículas positivas para GzmB após 6 h de incubação para cada uma das quatro populações de gotículas, exemplificada com dados da amostra CAR T do Doador 1. (C) A morte celular de fundo foi determinada em populações de gotículas de controle somente JeKo-1 e somente células T em cada ponto de tempo medido, com dados do doador 1. A morte celular de fundo é usada para calcular a frequência de células efetoras secretoras e matadoras de células GzmB vivas mostradas na Figura 7 e explicadas na etapa 3.3. Abreviaturas: Pré = encapsulamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67657/67657fig07.jpg"> 
Figura 7: Quantificação de células T capazes de secretar GzmB e matar células JeKo-1 em gotículas duplamente positivas. Gotículas duplamente positivas de dois doadores foram examinadas após 2 h, 4 h e 6 h de co-incubação em gotículas. (A) Frequência de células T que encontram células-alvo secretando GzmB e comparação entre células T NTD e células T CAR. (B) Frequência de células T que encontram células-alvo matando a célula-alvo co-encapsulada. Abreviaturas: GzmB = granzima B, NTD = não transduzido, PI = iodeto de propídio. * = Valor de P &lt; 0,05, ** = Valor de P &lt; 0,005, **** = Valor de P &lt; 0,0001 por ANOVA de duas vias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67657/67657fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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