Name: Análise de estabilidade de plasmídeo com microfluídica de gotículas de código aberto (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprenda análise de retenção de plasmídeos em bactérias usando microfluídica de código aberto com microgotículas de gel. Este método de alta vazão oferece quantificação precisa em células individuais.

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<ol><li>Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+plasmid+stability+under+non-selective+conditions+maintains+antibiotic+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Emergence of plasmid stability under non-selective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nat Commun. 10 (1), 2595(2019).</li>
<li>Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León-Sampedro, R., MacLean, R. C., Millán, ÁS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+horizontal+gene+transfer%3A+The+role+of+plasmids+in+bacterial+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beyond horizontal gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution.</a> Nat Rev Microbiol. 19 (6), 347(2021).</li>
<li>Wein, T., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmid evolution.</a> Curr Biol. 30 (19), R1158-R1163 (2020).</li>
<li>Chen, S., Larsson, M., Robinson, R. C., Chen, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+convenient+measurement+of+plasmid+stability+in+lab+and+clinical+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Direct and convenient measurement of plasmid stability in lab and clinical isolates of E. coli.</a> Sci Rep. 7 (1), 4788(2017).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Commun. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Silva, F., Queiroz, J. A., Domingues, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+metabolic+stress+and+plasmid+stability+in+plasmid+DNA+production+by+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Evaluating metabolic stress and plasmid stability in plasmid DNA production by Escherichia coli.</a> Biotechnol Adv. 30 (3), 691-708 (2012).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+novel+pJRD215-derived+plasmids+using+chloramphenicol+acetyltransferase+%28cat%29+gene+as+a+selection+marker+for+Acidithiobacillus+caldus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Construction of novel pJRD215-derived plasmids using chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene as a selection marker for Acidithiobacillus caldus.</a> PLoS ONE. 12 (8), e0183307(2017).</li>
<li>Moragues, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Droplet-based microfluidics.</a> Nat Rev Methods Primers. 3 (1), 32(2023).</li>
<li>Vitalis, C., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+interactions+in+microfluidic+droplets+for+enhanced+biotechnology+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Leveraging interactions in microfluidic droplets for enhanced biotechnology screens.</a> Current Opinion in Biotechnology. 82, 102966(2023).</li>
<li>Sinha, N., Subedi, N., Wimmers, F., Soennichsen, M., Tel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipette-tip+based+method+for+seeding+cells+to+droplet+microfluidic+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A pipette-tip based method for seeding cells to droplet microfluidic platforms.</a> J Vis Exp. (144), e57848(2019).</li>
<li>Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware%3A+From+DIY+trend+to+global+transformation+in+access+to+laboratory+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware: From DIY trend to global transformation in access to laboratory equipment.</a> PLOS Biol. 21 (1), e3001931(2023).</li>
<li>Murillo, L. F. R., Wenzel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Welcome+to+the+journal+of+open+hardware%5BTitle%5D)+AND+%22J+Open+Hardware%22%5BJournal%5D)">Welcome to the journal of open hardware.</a> J Open Hardware. 1 (1), (2017).</li>
<li>Shin, J. H., Choi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+and+do-it-yourself+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Open-source and do-it-yourself microfluidics.</a> Sens Actuators B Chem. 347, 130624(2021).</li>
<li>Pryszlak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+gut+microbiome+strains+for+cultivation-free+genome+sequencing+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep+Methods%22%5BJournal%5D)">Enrichment of gut microbiome strains for cultivation-free genome sequencing using droplet microfluidics.</a> Cell Rep Methods. 2 (1), 100137(2021).</li>
<li>Pollak, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+loop+assembly%3A+open%2C+efficient+and+cross-kingdom+DNA+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Universal loop assembly: open, efficient and cross-kingdom DNA fabrication.</a> Biology. 5 (1), (2020).</li>
<li>Volkmer, B., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Condition-dependent+cell+volume+and+concentration+of+Escherichia+coli+to+facilitate+data+conversion+for+systems+biology+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Condition-dependent cell volume and concentration of Escherichia coli to facilitate data conversion for systems biology modeling.</a> PLoS ONE. 6 (7), e23126(2011).</li>
<li>Li, H., et al. Squid: Simplifying quantitative imaging platform development and deployment. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2020).</li>
<li>Abate, A. R., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+multiple+emulsification+with+drop+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Faster multiple emulsification with drop splitting.</a> Lab Chip. 11 (11), 1911-1915 (2011).</li>
<li>Lau, B. T. C., Malkus, P., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+quantitative+methods+for+measuring+plasmid+loss+rates+reveal+unexpected+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">New quantitative methods for measuring plasmid loss rates reveal unexpected stability.</a> Plasmid. 70 (3), 353-361 (2013).</li>
<li>Oellermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+hardware+in+science%3A+The+benefits+of+open+electronics%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Open hardware in science: The benefits of open electronics.</a> Integr Comp Biol. 62 (4), 1061-1075 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>370533-25G</td><td>Para quebrar a emulsão</td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td>Para permeabilização celular</td></tr><tr><td>Ágar-Agar</td><td>Winkler</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Punção</td><td></td><td></td> de biópsia <td>0,75 mm e 1,8 mm</td></tr><tr>Tubo de cultura de <td>rodeio</td><td></td><td></td><td>de transiluminador LED azul</td> IO</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Dessecador <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de 15 mL <td>Com bomba de vácuo</td></tr><tr><td>Copo</td><td></td><td></td> descartável <td>Para misturar PDMS</td></tr><tr><td>Garfo</td><td></td><td></td> descartável <td>Para misturar PDMS</td></tr><tr><td>E. coli TOP10 cepa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscópio FluoPi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/FluoPi</td><td></td><td>Sistema de imagem de fluorescência verde para análise de placas</td></tr><tr><td>Óleo Fluorado</td><td>3M</td><td></td><td>Novec 7500</td></tr><tr><td>Aquecedor de vidro deslizante</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Para controlar a temperatura a 40 &graus; C de chip microfluídico</td></tr><tr><td>Lâminas de Vidro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de Aquecimento</td><td>Mecânico</td><td></td><td>Para evaporação Aquapel</td></tr><tr><td>Software de análise de imagem</td><td>Fiji/ImageJ</td><td></td><td>2.14.0/1.54f</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>MLAB Scientific / Para incubação de placas e microgéis&nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td></td><td></td><td>Para limpeza de lâminas de vidro</td></tr><tr><td>Canamicina</td><td></td><td></td><td>100 ug/mL concentração</td></tr><tr><td>Espalhador</td><td></td><td></td> em forma de L <td>Para espalhar bactérias em placas de ágar</td></tr><tr><td>Molde</td><td></td><td></td> mestre <td>Design de chip em wafer de silicone ou vidro</td></tr><tr><td>Microtubos</td><td></td><td></td><td>Solução de NaCl</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de 2 mL <td>Sódio cloreto 0,9% p/v</td></tr><tr><td>Estágio de microscopia aprimorado por estroboscópio de hardware de código aberto</td><td>https://github.com/wenzel-lab/flow-microscopy-platform</td><td></td><td>Para microscopia de campo claro</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Citotest</td><td>2303-1090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>Aquecedor de ponta de pipeta</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller/tree/master/module-heating-and-stirring</td><td></td><td>Para controlar a temperatura a 40 > C da ponta da pipeta</td></tr><tr><td>Limpador de plasma</td><td>Diener 117056 eletrônico</td><td></td><td>Para colagem de PDMS com uma lâmina de vidro</td></tr><tr><td>Plasmídeo pCA_Odd1</td><td></td><td></td><td>codifica sfGFP e resistência à canamicina</td></tr><tr><td>Tubulação de politetrafluoretileno (PTFE)</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meio Luria Bertoni pré-misturado</td><td>US Biological Life Science</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodeto (PI)</td><td></td><td></td><td>Para coloração</td></tr> Sistema <tr><td>controlador de pressão e fluxo à base de Raspberry Pi</td><td>https://github.com/wenzel-lab/modular-microfluidics-workstation-controller</td><td></td><td>Para controlar a pressão e as taxas de fluxo</td></tr><tr><td>Base de elastômero de silicone</td><td>Kit Sylgard</td><td></td><td>PDMS - 184 Kit de elastômero de silicone</td></tr><tr><td>Agente de cura de elastômero de silicone</td><td>Kit Sylgard</td><td></td><td>PDMS - 184 Kit de elastômero de silicone</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td></td><td></td><td>Para medir a absorbância</td></tr><tr><td>Microscópio SQUID</td><td>https://github.com/wenzel-lab/SQUID-bioimaging-platform</td><td></td><td>Sistema de imagem multifluorescência para análise de células coradas</td></tr><tr><td>Alça</td><td></td><td></td> estéril <td>Para escolher uma colônia e estriar o revestimento</td></tr><tr><td>Surfactante</td><td>Esfera Fluídica</td><td></td><td>Pico-Surf</td></tr><tr><td>Seringas</td><td>NIPRO</td><td></td><td>Com filtros e tubos</td></tr><tr><td>Agitador com temperatura controlada</td><td>Mundo Lab</td><td></td><td>DLAB HCM100-Pro</td></tr><tr><td>Pinça</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose de temperatura gelificante ultrabaixa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td>Para gerar esferas de hidrogel Solução</td></tr><tr><td>repelente de água (fluoroalquil silano)</td><td>Aquapel</td><td></td><td>Para tratamento microcanais do dispositivo PDMS</td></tr></tbody></table>

análise de estabilidade de plasmídeo com microfluídica de gotículas de código aberto

Plasmid Stability Analysis with Open-Source Droplet Microfluidics

Validação do encapsulamento celular e formação de microcolônias
O encapsulamento celular pode ser confirmado visualmente realizando microscopia de campo claro nas microgotículas de gel antes de quebrar a emulsão e lavar os microgéis. Um resultado representativo da emulsão nesta etapa é mostrado na Figura 4.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig4.jpg"> 
Figura 4: Seção de uma imagem de sobreposição de microscopia de fluorescência. Após incubação durante a noite, microcolônias representativas de sfGFP expressando colônias de E. coli dentro de microgotículas de gel. Foi utilizada uma objetiva microscópica com aumento de 10x e 0,30 NA. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Resultados da análise de imagem
Uma vez que os microgéis são corados e de campo claro, bem como os canais de fluorescência adquiridos em várias posições, as colônias identificadas como negativas nas imagens originais podem ser visualizadas (ver Figura 5A). Os dados extraídos de todas as imagens de um experimento podem ser plotados para mostrar a taxa de fluorescência de várias colônias, destacando aquelas que perderam a fluorescência codificada por plasmídeo (ver Figura 5B). Os resultados indicam que 100 colônias perderam seu plasmídeo ou funcionalidade de plasmídeo de um total de 2785 microcolônias analisadas, correspondendo a 3,6%.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig5.jpg"> 
Figura 5: Quantificação de microcolônias negativas. (A) Seção de uma imagem de sobreposição de microscopia de fluorescência. Após a remoção e coloração do óleo, colônias representativas em microgéis expressando sfGFP e duas colônias negativas mostraram a fluorescência vermelha da coloração de DNA (circulada em preto). Barra de escala: 100 μm. (B) Gráfico de dispersão dos valores de fluorescência de microcolônias individuais extraídas de 16 imagens de microscopia multicanal. As colônias sem fluorescência verde foram contadas como negativas, conforme indicado em vermelho no gráfico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Quantificação de placas de ágar
As imagens das placas triplicadas são mostradas na Figura 6, com colônias não fluorescentes indicadas por setas brancas. A primeira placa (Figura 6A) exibiu um total de 213 colônias, das quais 1 não era fluorescente. A segunda placa (Figura 6B) tinha um total de 49 colônias, sem colônias não fluorescentes. A terceira placa (Figura 6C) mostrou um total de 252 colônias, 6 das quais não eram fluorescentes. Esses resultados correspondem a uma taxa média de perda de plasmídeo de colônia de 2,3%, com um grande desvio padrão de 3,2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67659/67659fig6.jpg"> 
Figura 6: Identificação de colônias negativas em placas. (A-C) Colônias fluorescentes e não fluorescentes de E. coli em placas de ágar LB (diâmetro: 90 mm, altura: 15 mm). O inóculo, derivado de E. coli com sfGFP a partir do estoque de -80 °C, foi listrado no dia 1, cultivado com antibiótico no dia 2 e diluído 1:100 diariamente do dia 3 ao 6 para permitir a perda de plasmídeo. As colônias foram incubadas a 37 ° C por 24 h e fotografadas em uma câmara FluoPi. As colônias não fluorescentes foram aprimoradas com GIMP e indicadas com setas brancas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67659/67659fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Análise de estabilidade de plasmídeo com microfluídica de gotículas de código aberto

Plasmids play a vital role in synthetic biology by enabling the introduction and expression of foreign genes in various organisms, thereby facilitating ...

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Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

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