Análise de estabilidade de plasmídeo com microfluídica de gotículas de código aberto

Desenvolvemos métodos de IC microfílicos de alto rendimento para estudar a diversidade da população celular e as interações célula-célula. Nesse contexto, as microgotículas de gel nos permitem realizar etapas úteis do protocolo, como manipulação de DNA de coloração de lise e microscopia de maneira altamente paralisada em células presas. Os fluxos de trabalho microfílicos de gotículas são conhecidos pelo rendimento ultra-alto e versatilidade, mas a adoção geralmente é limitada pela necessidade de instrumentação de ponta e conhecimento especializado.

Nosso protocolo melhora as técnicas tradicionais usando análise de célula única de alto rendimento com coloração fluorescente e um fluxo de trabalho de microscopia de código aberto acessível. Ele encapsula células em microgotículas de gel por meio de microfluídica para analisar minicélulas e microcolônias simultaneamente. Embora as culturas em massa e em placas careçam de especificidade e resolução, esse método gera estatísticas precisas e representativas de diversos fenômenos.

Nossos protocolos combinam microfluídica de gotículas, microscopia fluorescente e hardware de código aberto em um método baseado em etiquetas. Essa abordagem torna a análise de célula única mais flexível e acessível, permitindo que a comunidade científica aborde questões científicas complexas sobre comunidades microbianas. Para começar, aqueça a agarose de temperatura de gelificação ultrabaixa a uma concentração de 2% a 90 graus Celsius em Luria Bertani, ou caldo LB.

Agite a mistura por 10 minutos em um agitador com temperatura controlada e, em seguida, reduza a temperatura do agitador térmico para 39 graus Celsius para resfriar a solução de agarose. Coloque o tubo de suspensão de Escherichia coli no agitador térmico por quatro minutos para aquecê-lo a 39 graus Celsius. Misture a suspensão bacteriana e a solução de agarose na proporção de um para um para obter uma concentração de agarose de 1% com uma suspensão celular de 3,1 vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Preparar a solução de controlo negativo para a monitorização da contaminação utilizando LB e suspensão de agarose na proporção de um para um. Obtenha a plataforma de fluxo de código aberto completa, incluindo drivers de pressão de gás e sensores de fluxo. Inclua uma lâmina de vidro e aquecedores de ponta de pipeta na configuração para controlar a temperatura da amostra de célula de agarose à medida que ela entra no chip.

Em seguida, posicione o chip microfluídico no estágio de microscopia aprimorada por estroboscópio, garantindo que a junção de geração de gotículas seja visível. Defina o aquecedor da ponteira da pipeta e o aquecedor da lâmina de vidro para 40 graus Celsius usando a interface do software de controle. Usando uma seringa com tubo e um plugue PDMS, carregue a mistura de suspensão de células de agarose 1% em uma ponta de pipeta de 200 microlitros.

Insira a ponta no aquecedor de ponta e coloque-a na entrada da fase aquosa no chip microfluídico. Troque a vedação PDMS da ponta pela conectada à tubulação do sistema de controle de fluxo. Em seguida, insira o tubo de óleo na segunda entrada e a extremidade do tubo de saída em um tubo de resíduos.

Em seguida, defina a pressão para 80 milibares para as fases de aquiescência e óleo na interface do usuário e inicie a infusão da suspensão da célula e do óleo. Ajuste a fase oleosa para 320 milibares e a fase de aquiescência para 180 milibares. Aguarde um minuto para a estabilização da geração de gotículas.

Assim que a geração de gotículas se estabilizar, transfira a tubulação de saída do tubo de resíduos para o tubo de coleta. Continue coletando gotículas no gelo até que o sample reservatório está vazio. Após a coleta, coloque os tubos a quatro graus Celsius por uma hora para deixar o gel de agarose dentro das gotículas.

Incube as microgotículas de gel contendo bactérias e as gotículas de controle negativo a 37 graus Celsius por quatro horas ou durante a noite para o crescimento da colônia. Após a incubação, use uma seringa de três mililitros com uma agulha de calibre 21 para remover cuidadosamente o máximo de óleo possível da base da emulsão de microgotículas de gel. Transfira 50 microlitros das microgotículas de gel para um novo microtubo e armazene-o a quatro graus Celsius para posterior análise de gotículas, adicione uma mistura um-para-um de óleo fluorado com PFO em um volume igual à emulsão restante.

Em seguida, adicione aproximadamente 200 microlitros de tampão cloreto de sódio a 0,9% em cima da emulsão. Vortex a mistura e gire-a brevemente em uma centrífuga de velocidade fixa. Remova cuidadosamente a fase oleosa da parte inferior da interface líquida e descarte 100 microlitros de solução de cloreto de sódio da parte superior.

Transfira dois microlitros de microgotículas de gel para uma lâmina de câmara de imagem e adicione cinco microlitros de óleo fluorado para ajudar a formar uma monocamada de gotículas para uma imagem ideal. No microscópio, ative a iluminação da matriz de LED branco na parte superior para imagens de campo claro. Monte o slide preparado.

Concentre-se na amostra para localizar uma monocamada de gotículas e capturar uma imagem de campo claro. Em seguida, ajuste a roda do filtro para alinhar com o filtro de comprimento de onda verde. Mude para o LED de 470 nanômetros para excitação e, sem mover a amostra, capture uma imagem fluorescente das colônias.

Transfira dois microlitros de microgéis corados com iodeto de propídio para um chip de câmara de imagem e adicione cinco microlitros de solução de cloreto de sódio a 0,9% para formar uma monocamada de microgéis. Vede a entrada e a saída do chip para evitar a evaporação durante a imagem. Ajuste o filtro de intervalo de comprimento de onda vermelho para imagens de iodeto de propídio e capture as imagens de campo claro e fluorescentes.

O encapsulamento celular em microgotículas de gel foi confirmado por microscopia de campo claro, que mostra gotículas uniformes com células encapsuladas distintas. As colônias que perderam fluorescência codificada por plasmídeo foram identificadas usando análise de razão de fluorescência. De 2.785 colônias analisadas, 100 colônias perderam fluorescência, indicando uma taxa de perda de plasmídeo de 3,6%