Name: Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a desenvolver organoides intestinais suínos bidimensionais que refletem propriedades fisiológicas do intestino nativo. Este modelo inovador utiliza câmaras de Ussing e medições de TEER para estudar características de transporte em tempo real, oferecendo uma alternativa promissora aos experimentos animais clássicos em pesquisa gastrointestinal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Para este protocolo, dois suínos saudáveis (porco Bentheim Blacked Pied; 1 macho, 1 fêmea; 4,5 meses de idade; aproximadamente 65 kg) foram sacrificados por tiro de parafuso em cativeiro e sangramento. De acordo com a Lei de Proteção Animal, isso (abate e remoção de tecidos) não é classificado como um experimento animal, mas deve ser anunciado ao oficial de bem-estar animal (registro nº. TiHo-T-2023-15) da Fundação Hannover da Universidade de Medicina Veterinária.
1. Revestimento de inserções
NOTA: Todas as etapas são realizadas com materiais estéreis sob um gabinete de segurança. Todas as etapas do protocolo são realizadas no gelo, se não for indicado o contrário.
<ol>
	<li>Descongele a membrana basal congelada no gelo por pelo menos 1 h em temperatura ambiente ou durante a noite no gelo a 4 °C. Misture a membrana basal 1:40 (v/v) com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) gelada em um tubo cônico.</li>
	<li>Remova as placas estéreis com inserções da embalagem. Adicione 200 μL de mistura de membrana basal ao compartimento apical de cada inserto.</li>
	<li>Recoloque a tampa da placa do poço e incube por pelo menos 1,5 h a 37 °C, 5% de CO2 em uma incubadora.</li>
	<li>Aspire a solução cuidadosamente antes de semear as células. Certifique-se de que a ponta não toque na membrana durante a aspiração.</li>
</ol>
2. Geração de monocamadas organoides 2D
NOTA: Os organoides do cólon suíno são gerados e cultivados conforme descrito para organoides jejunais suínos25. Após a geração de organoides 3D, eles devem ser cultivados por pelo menos 3-4 semanas durante a passagem semanal para garantir um crescimento consistente. O número de células dentro de cada cúpula contendo organoides 3D, que são dissolvidos nas etapas subsequentes, é suficiente para cobrir um único filtro transmembrana. Antes da geração da monocamada, os organoides 3D foram submetidos ao controle de qualidade óptica para verificar o crescimento prévio e possível contaminação (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg"> 
Figura 1: Organoides 3D representativos. Os organoides tridimensionais (A) jejuno e (B) do cólon são cuidadosamente examinados ao microscópio antes de gerar monocamadas. Atenção especial é dada à avaliação de padrões de crescimento anteriores, integridade estrutural e presença de quaisquer impurezas ou contaminação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol>
	<li>Remova o meio organoide (Tabela 1) dos poços com organoides de cripta 3D. Adicione 1 mL de PBS gelado por poço e dissolva suavemente a membrana basal pipetando para cima e para baixo com uma ponta p1000.</li>
	<li>Colete todos os organoides dissolvidos em um tubo de 15 mL pré-preenchido com 10 mL de PBS gelado. Centrifugar o tubo a 250 x g, 10 min a 4 °C. Aspire o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspenda o pellet em 1 mL de tripsina/EDTA quente (37 °C) a 0,05% (v/v) (2 tubos podem ser agrupados nesta fase). Incubar durante 5 min a 37 °C em banho-maria e colocar diretamente no gelo para interromper a reação.</li>
	<li>Ressuspenda no gelo 20x com ponta p1000 e outro 15x com ponta p1000 + ponta p200 por cima. Adicione 10 mL de DMEM gelado suplementado com 10% (v/v) de soro fetal de bezerro (FCS).</li>
	<li>Tubo de centrífuga a 1.000 x g, 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de meio monocamada (Tabela 1).</li>
	<li>Determine o número de células vivas por mL usando uma câmara de Neubauer de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Retirar a solução de revestimento neste ponto do compartimento apical e substituí-la por 500 μl de meio monocamada quente (37 °C). Adicione 3 mL de meio monocamada ao compartimento basolateral.</li>
	<li>Determine a resistência em branco (TEER) de cada inserto de transwell vazio, conforme descrito em detalhes na etapa 3. O tempo em que nenhum meio está presente na câmara apical deve ser o mais curto possível para evitar que as células sequem.</li>
	<li>Remover o meio monocamada apical e adicionar para a cultura 2D jejunal 2 x 105 células epiteliais e para a cultura 2D colónica 1,5 x 105 células epiteliais em 500 μL de meio monocamada na câmara apical de cada poço.</li>
	<li>Troque o meio e meça o TEER a cada 2-3 dias. Meça o TEER antes que o meio seja trocado. Aspirar cuidadosamente o meio do compartimento apical e basal e substituí-lo por 500 μL ou 3 ml de meio fresco e quente (37 °C).<ol>
		<li>Para organoides jejuno: no dia 16, após a semeadura, mude de meio monocamada para meio de diferenciação (Tabela 1). Para organoides do cólon: mude o meio no dia 7 para o meio de diferenciação.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Troque o meio de diferenciação todos os dias e realize a medição TEER durante cada troca de meio. No dia 18 (para organoides jejunais) ou no dia 9 (para organoides do cólon), após a semeadura, prossiga com os experimentos funcionais.</li>
</ol>
3. Medição da resistência elétrica transepitelial (TEER)
NOTA: Todas as medições são realizadas sob um gabinete de segurança para evitar contaminação. Antes de semear as células, cada transwell revestido vazio é medido para obter valores individuais em branco. O volt-ohm
<ol>
	<li>Limpe o eletrodo do pauzinho com etanol a 70% (v/v) e deixe o eletrodo secar completamente. Enquanto isso, remova a placa da incubadora e coloque-a sob o gabinete.</li>
	<li>Introduza o braço curto do eletrodo do pauzinho no compartimento apical das pastilhas e o braço longo no compartimento basolateral da pastilha. Evite o contato do braço curto com a camada de células.</li>
	<li>Meça a resistência elétrica transepitelial de cada poço trans. Deixe o volt-ohmímetro se equilibrar para garantir uma medição estável. Meça os valores TEER clicando no botão Armazenar.</li>
	<li>Continue as etapas 3.2 e 3.3 com os poços restantes. Depois de chegar ao último poço, o volt-ohm Clique em Salvar.</li>
	<li>Limpe o eletrodo após cada placa e no final da medição e deixe-o secar completamente antes de armazená-lo.</li>
	<li>Subtraia os valores em branco determinados antes de semear as células dos valores celulares medidos.</li>
</ol>
4. Estudos de transporte eletrofisiológico utilizando a técnica da câmara de Ussing
NOTA: A determinação dos estudos de transporte eletrofisiológico é realizada usando uma câmara de Ussing composta por dois compartimentos de câmara, que são divididos pelo epitélio. Esta câmara é conectada a um grampo de tensão por eletrodos Ag / AgCl. Esta técnica permite o rastreamento de processos ativos de transporte eletrogênico do epitélio através das mudanças na corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela pinça de tensão, bem como a resistência do tecido (Rt) calculada pela lei de Ohm. Isc e Rt são registrados a cada 6 s durante todo o experimento. Durante o experimento, o tecido investigado é aerado com carbogênio e incubado com soluções de Krebs-Henseleit modificadas para garantir condições viáveis. A indometacina (10 μM) é adicionada às soluções tampão para inibir a síntese de prostaglandinas26.
<ol>
	<li>Aquecer as soluções tampão da mucosa e da sorosidade a 37 °C e arejar com carbogénio. Monte as câmaras individuais usando um inserto vazio para cada câmara individual. Certifique-se de que os lados apicais dos transpoços estejam todos voltados para a mesma direção.</li>
	<li>Encha todas as câmaras com 5 mL de solução tampão mucosa pré-aquecida (Tabela 2). Conecte todos os eletrodos do grampo de tensão às câmaras individuais de acordo com as instruções do fabricante. Certifique-se de que nenhuma bolha de gás esteja interferindo nos eletrodos para garantir a medição correta.</li>
	<li>Calibre o software da câmara de Ussing com essas condições clicando no botão Rf/dpI no voltage clamp software. A resistência de todas as pastilhas vazias usadas deve ser igual (~ 70 Ohm) e a corrente deve ser em torno de 0 mV (± 5 mV). Se este não for o caso de algumas câmaras, verifique a colocação adequada de eletrodos ou bolhas no sistema.</li>
	<li>Remova todos os eletrodos e descarte a solução tampão usada. Abra todas as câmaras individuais e remova as inserções vazias. Certifique-se de que a ordem das câmaras individuais seja mantida.</li>
	<li>Mova a placa do poço com inserções da incubadora para o gabinete de segurança. Aspire cuidadosamente o meio basolateral e apical.</li>
	<li>Lave as células adicionando 500 μL de tampão mucoso quente (37 ° C) à câmara apical e 3 mL de tampão seroso à câmara basolateral. Aspire os tampões e repita 2x.</li>
	<li>Remova as inserções da placa. Remova cuidadosamente os suportes das inserções. Coloque os insertos nas câmaras de Ussing e certifique-se de que a orientação dos insertos seja a mesma da fase de calibração. Monte as câmaras individuais conforme exibido na Figura 2.</li>
	<li>Encha as câmaras voltadas para o lado basolateral das células com 5 mL de tampão seroso (Tabela 2) e a câmara voltada para a câmara apical com 5 mL de tampão mucoso.</li>
	<li>Conecte os eletrodos e os tubos de aeração a cada câmara individual. Inicie a medição no software Ussing. Deixe o equilíbrio por 15 min.</li>
	<li>Altere as condições de circuito aberto para condições de curto-circuito. Equilibre por 5 min a 10 min. Adicione 10 μM de forscolina à câmara serosa. NOTA: A adição de forscolina pode ser substituída por outros agentes / substâncias, dependendo de segmentos intestinais individuais e questões de pesquisa.</li>
	<li>Após 15 minutos, adicione mais agentes da mesma maneira que a forscolina ou interrompa a medição. Remova os tubos de aeração e eletrodos de câmaras individuais. Despeje as soluções tampão de ambas as câmaras em uma tigela.</li>
	<li>Desmonte as câmaras e descarte as inserções ou use-as para análise de acompanhamento (por exemplo, imuno-histoquímica ou análise de expressão)</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg"> 
Figura 2: Estrutura esquemática da câmara de Ussing. Exibidas são ambas as câmaras divididas pela membrana com a monocamada 2D crescida. Ambas as câmaras são aeradas com carbogênio; A tensão e a corrente são monitoradas por dois eletrodos por câmara. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
5. Análise dos dados gerados pela configuração da câmara de Ussing
<ol>
	<li>Importe os dados gerados pelo software de pinça de tensão para um editor de planilhas adequado.</li>
	<li>Para determinar os valores basais Isc e Rt , calcule a média de 10 pontos de dados consecutivos obtidos 10 minutos após a inicialização das condições de curto-circuito. Cada câmara individual serve como uma réplica técnica, enquanto cada passagem de organoides serve como uma réplica biológica.</li>
	<li>Para avaliar os efeitos dos agentes aplicados, calcule a média de 10 pontos de dados consecutivos imediatamente antes da adição do agente. Compare essa média com o valor máximo (ou mínimo) observado após a aplicação do agente. Os dados obtidos são apresentados como média ± desvio padrão (DP).</li>
</ol>

<ol><li>Hornbuckle, W. E., Tennant, B. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHornbuckle%2C+WE+%22Clinical+Biochemistry+of+Domestic+Animals%22">Clinical Biochemistry of Domestic Animals</a>. , Academic Press. 367-406 (1997).</li>
<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>Pham, T. A., Lawley, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+on+intestinal+dysbiosis+during+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights on intestinal dysbiosis during bacterial infections.</a> Curr Opin Microbiol. 17 (100), 67-74 (2014).</li>
<li>Garrett, W. S., Gordon, J. I., Glimcher, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostasis+and+inflammation+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeostasis and inflammation in the intestine.</a> Cell. 140 (6), 859-870 (2010).</li>
<li>Ternhag, A., Torner, A., Svensson, A., Ekdahl, K., Giesecke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+bacterial+gastrointestinal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of bacterial gastrointestinal infections.</a> Emerg Infect Dis. 14 (1), 143-148 (2008).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+principles+of+humane+experimental+technique%22">The principles of humane experimental technique</a>. , Methuen & Co. Limited. London. (1959).</li>
<li>Zietek, T., Boomgaarden, W. A. D., Rath, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening%2C+oral+bioavailability+and+regulatory+aspects%3A+A+need+for+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Drug screening, oral bioavailability and regulatory aspects: A need for human organoids.</a> Pharmaceutics. 13 (8), 1280(2021).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), e66465(2013).</li>
<li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell Tissue Res. 365 (1), 123-134 (2016).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell Tissue Res. 375 (2), 409-424 (2019).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+intestinal+enteroids%3A+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> J Virol. 93 (5), e01682-e01718 (2019).</li>
<li>Min, S., Kim, S., Cho, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+tract+modeling+using+organoids+engineered+with+cellular+and+microbiota+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal tract modeling using organoids engineered with cellular and microbiota niches.</a> Exp Mol Med. 52 (2), 227-237 (2020).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminopeptidase+N+expression%2C+not+interferon+responses%2C+determines+the+intestinal+segmental+tropism+of+porcine+deltacoronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Aminopeptidase N expression, not interferon responses, determines the intestinal segmental tropism of porcine deltacoronavirus.</a> J Virol. 94 (14), e00480-e00520 (2020).</li>
<li>van der Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 375(2020).</li>
<li>van der Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced%2C+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Res. 28, 165-171 (2018).</li>
<li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+piglet+intestinal+3D+organoids+from+cryopreserved+epithelial+crypts+and+establishment+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of piglet intestinal 3D organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers.</a> J Vis Exp. (192), e64917(2023).</li>
<li>Ussing, H. H., Zerahn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+transport+of+sodium+as+the+source+of+electric+current+in+the+short-circuited+isolated+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 23 (2-3), 110-127 (1951).</li>
<li>Dengler, F., Kraetzig, A., Gabel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butyrate+protects+porcine+colon+epithelium+from+hypoxia-induced+damage+on+a+functional+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Butyrate protects porcine colon epithelium from hypoxia-induced damage on a functional level.</a> Nutrients. 13 (2), 305(2021).</li>
<li>Guschlbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-resveratrol+and+epsilon-viniferin+decrease+glucose+absorption+in+porcine+jejunum+and+ileum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Trans-resveratrol and epsilon-viniferin decrease glucose absorption in porcine jejunum and ileum in vitro.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 165 (3), 313-318 (2013).</li>
<li>Herrmann, J., Hermes, R., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+and+intraepithelial+metabolism+of+short-chain+fatty+acids+%28SCFA%29+in+the+porcine+proximal+colon+are+influenced+by+SCFA+concentration+and+luminal+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport and intraepithelial metabolism of short-chain fatty acids (SCFA) in the porcine proximal colon are influenced by SCFA concentration and luminal pH.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 158 (1), 169-176 (2011).</li>
<li>Klinger, S., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+inhibits+porcine+intestinal+glucose+and+alanine+transport%3A+Potential+roles+of+Na%28%2B%29%2FK%28%2B%29-ATPase+activity%2C+protein+kinase+A%2C+AMP-activated+protein+kinase+and+the+association+of+selected+nutrient+transport+proteins+with+detergent+resistant+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Resveratrol inhibits porcine intestinal glucose and alanine transport: Potential roles of Na(+)/K(+)-ATPase activity, protein kinase A, AMP-activated protein kinase and the association of selected nutrient transport proteins with detergent resistant membranes.</a> Nutrients. 10 (3), 302(2018).</li>
<li>Leonhard-Marek, S., Hempe, J., Schroeder, B., Breves, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+chloride+secretion+across+the+jejunum+and+colon+of+pigs+as+affected+by+age+and+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of chloride secretion across the jejunum and colon of pigs as affected by age and weaning.</a> J Comp Physiol B. 179 (7), 883-896 (2009).</li>
<li>Schroeder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventive+effects+of+the+probiotic+Escherichia+coli+strain+Nissle+1917+on+acute+secretory+diarrhea+in+a+pig+model+of+intestinal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Preventive effects of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 on acute secretory diarrhea in a pig model of intestinal infection.</a> Dig Dis Sci. 51 (4), 724-731 (2006).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), e0256143(2021).</li>
<li>Ferreira, S. H., Moncada, S., Vane, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indomethacin+and+aspirin+abolish+prostaglandin+release+from+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+New+Biol%22%5BJournal%5D)">Indomethacin and aspirin abolish prostaglandin release from the spleen.</a> Nat New Biol. 231 (25), 237-239 (1971).</li>
<li>Dykstra, G. D., Kawasaki, M., Ambrosini, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancements+in+bovine+organoid+technology+using+small+and+large+intestinal+monolayer+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Advancements in bovine organoid technology using small and large intestinal monolayer interfaces.</a> J Vis Exp. (208), e67010(2024).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cells+as+a+model+for+studying+physiological+properties+and+toxin-induced+effects+on+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Caco-2/HT29-MTX co-cultured cells as a model for studying physiological properties and toxin-induced effects on intestinal cells.</a> PLoS One. 16 (10), e0257824(2021).</li>
<li>Beduneau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tunable+Caco-2%2FHT29-MTX+co-culture+model+mimicking+variable+permeabilities+of+the+human+intestine+obtained+by+an+original+seeding+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A tunable Caco-2/HT29-MTX co-culture model mimicking variable permeabilities of the human intestine obtained by an original seeding procedure.</a> Eur J Pharm Biopharm. 87 (2), 290-298 (2014).</li>
<li>Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+expression+of+claudin+proteins+correlates+with+tight+junction+barrier+properties+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine.</a> J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).</li>
<li>Pearce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+intestinal+epithelia+as+models+for+absorption+enhancement+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies.</a> Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).</li>
<li>Moeser, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+signaling+pathways+activated+by+weaning+mediate+intestinal+dysfunction+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).</li>
<li>Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dysfunction+induced+by+early+weaning+is+attenuated+by+delayed+weaning+and+mast+cell+blockade+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).</li>
<li>Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin%3A+unique+diterpene+activator+of+adenylate+cyclase+in+membranes+and+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).</li>
<li>Herrmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+diversity+of+electrogenic+glucose+transport+characteristics+in+the+small+intestines+of+weaned+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).</li>
<li>Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+in+health+and+disease--sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption in health and disease--sugars.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).</li>
<li>Crane, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B+-dependent+transport+in+the+intestine+and+other+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Fed+Proc%22%5BJournal%5D)">Na+ -dependent transport in the intestine and other animal tissues.</a> Fed Proc. 24 (5), 1000-1006 (1965).</li>
<li>Inagaki, A., Yamaguchi, S., Ishikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride-sensitive+epithelial+Na%2B+channel+currents+in+surface+cells+of+rat+rectal+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Amiloride-sensitive epithelial Na+ channel currents in surface cells of rat rectal colon.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 286 (2), C380-C390 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Placa de 24 poços</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10432</td><td>Armazenar a -20 &deg;C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Alemanha</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Medium Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>12634010</td><td>Loja em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>17504044</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>C3306</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>D(+)-Glicose (wasserfrei)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.08337</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-13027</td><td>Armazenar a -20 ° C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>D-Manitol</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>M4125</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>154938</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Conjunto de eletrodos (AgCl / PtIr / Std.)</td><td>Instrumentos Científicos, Simmerath, Alemanha</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburgo, Alemanha</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, Hamburgo, Alemanha</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm Meter</td><td>World precision instruments, Sarasota, EUA</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>F7524</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>F6886</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Alemanha</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin 1</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-P1097</td><td>Loja a -20 °C. Descongele quando necessário</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>35050061</td><td>Loja a 4 °C.&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>1090571000</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>H0887</td><td>Armazenar em 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Gabinete de Segurança Biológica Classe II</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>Incubadora 51033316</td><td></td></tr><tr><td>ICO105</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Alemanha</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>I7378</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.04936</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>G7513</td><td>Loja a -20 °C. Descongele quando necessário</td></tr><tr><td>LWRN Supernatant</td><td>selfmade&nbsp;</td><td></td><td>Armazene a -20 ° C. Descongele quando necessário. O suplemento LWRN é produzido de acordo com Miyoshi et al. (2012</td></tr><tr><td>)Matriz de Membrana Basal Matrigel, sem LDEV, 10 mL</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>354234</td><td>Store a -20 °C. Descongele cuidadosamente no gelo quando necessário</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Alemanha</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.05833</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.06580</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>N-Acetil-L-cisteína</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>A7250</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.06404</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.06346</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha</td><td>1.06329</td><td>Armazenar em temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Câmara melhorada Neubauer</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&ouml; n, Alemanha</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio invertido Olympus IX70</td><td>Olympus Corporation, Hamburgo, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>15140122</td><td>Loja a -20 °C. Descongele quando necessário</td></tr><tr><td>PolymyxinB</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Alemanha</td><td>P4932-1MU</td><td>Armazene a -20 °C. Descongele quando necessário</td></tr><tr><td>Suporte de microscópio Primovert com fototubo binocular</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>rm EGF</td><td>Prepotech, New Jersey, USA</td><td>315-09</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10295</td><td>Armazenar a -20 °C. Descongelar quando necessário</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Base System</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Alemanha</td><td>#1317</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Diffusion Chamber</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Alemanha</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>Voltage/Current Clamp VCC6</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Alemanha</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, New Jersey, EUA</td><td>HY-10583</td><td>Armazene a -20 graus C. Descongele quando necessário</td></tr></tbody></table>

organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

Este protocolo facilita a geração confiável de monocamadas 2D suínas, desagregando organoides 3D derivados do jejuno e do cólon de porcos. Durante um período de cultivo de 16 dias para organoides do jejuno e 9 dias para organoides do cólon, são formadas monocamadas intactas. Essas monocamadas podem ser usadas posteriormente para avaliar propriedades de transporte eletrogênico e fisiológico usando a técnica da câmara de Ussing.
Depois de desintegrar os organoides 3D, células individuais são sem...

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

The gastrointestinal tract (GIT) serves both in the digestion of food and the uptake of nutrients but also as a protective barrier against pathogens. ...

two-dimensional-porcine-intestinal-organoids-reflecting-physiological

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo permite a diferenciação de células pluripotentes humanas em organoides intestinais. O protocolo mimetiza o desenvolvimento humano normal, diferenciando as células em uma população de endoderme definitivo, endoderme do intestino posterior e, em seguida, epitélio intestinal. Isso torna o protocolo adequado para estudar tanto o desenvolvimento intestinal quanto aplicações de modelagem de doenças.

Geração de organoides intestinais derivados de hiPSC para aplicações de modelagem de doenças e desenvolvimento

Organoides intestinais derivados da biópsia e tecnologias de órgãos em chips são combinados em uma plataforma microfisiológica para recapitular a funcionalidade intestinal específica da região.

Combinando organoides humanos e tecnologia organ-on-a-chip para modelar funcionalidade específica da região intestinal

Este protocolo descreve um modelo de enterocolite necrosante a apical (NEC)-in-a-dish utilizando pequenos enteróides intestinais com polaridade invertida, permitindo o acesso à superfície apical. Fornecemos um protocolo de coloração imunofluorescente para detectar interrupção epitelial relacionada à NEC e um método para determinar a viabilidade de enteróides apical-out submetidos ao protocolo NEC-in-a-dish.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

O presente protocolo descreve o estabelecimento de um sistema organoide colônico murino para estudar a atividade e o funcionamento das células-tronco colônicas em um modelo knockout de claudina-7.

Cultura tridimensional de criptas colônicas murinas para estudar a função das células-tronco intestinais ex vivo

Neste trabalho, descrevemos um protocolo de cultivo de organoides 3D intestinais de suínos a partir de criptas epiteliais criopreservadas. Descrevemos também um método para estabelecer monocamadas celulares derivadas de organoides 3D, permitindo o acesso ao lado apical de células epiteliais.

Cultura de Organoides 3D Intestinais de Leitões a partir de Criptas Epiteliais Criopreservadas e Estabelecimento de Monocamadas Celulares

Aqui, apresentamos um protocolo para gerar organoides intestinais de ratos e usá-los em várias aplicações a jusante. Os ratos são frequentemente um modelo pré-clínico preferido, e o robusto sistema organoide intestinal preenche a necessidade de um sistema in vitro para acompanhar os estudos in vivo .

Geração e Manipulação de Organoides Intestinais em Rato

A integração de organoides intestinais caninos e um sistema microfluídico Gut-on-a-Chip oferece modelos translacionais relevantes para doenças intestinais humanas. Os protocolos apresentados permitem a morfogênese 3D e a modelagem dinâmica in vitro do intestino, auxiliando no desenvolvimento de tratamentos eficazes para doenças intestinais em cães e humanos com o One Health.

Morfogênese Tridimensional em Intestino Canino Utilizando Organoides Intestinais Derivados de Pacientes com Doença Inflamatória Intestinal

Os enteróides estão emergindo como um novo modelo para o estudo da fisiologia e fisiopatologia tecidual, desenvolvimento de drogas e medicina regenerativa. Aqui, descrevemos um sistema de cultura 2D derivado de enteróides de células primárias bovinas que permite o co-cultivo com tipos de células teciduais relevantes. Este modelo oferece uma vantagem translacional para a modelagem de pesquisa gastrointestinal.

Geração de um Sistema de Cultura Bidimensional Monocamada Derivada de Enteróides Bovinos Primários para Aplicações em Pesquisa Biomédica Translacional

Este estudo apresenta um protocolo para geração de monocamadas 2D intestinais bovinas a partir de organoides, oferecendo melhor acesso para o estudo das interações patógeno-hospedeiro. Inclui métodos para avaliar a integridade e funcionalidade da membrana, avançando modelos in vitro que imitam a fisiologia gastrointestinal do gado. Essa abordagem promete benefícios biomédicos e agrícolas significativos, incluindo estratégias de tratamento aprimoradas.

Avanços na tecnologia de organoides bovinos usando interfaces de monocamada de intestino delgado e grosso

Este vídeo ilustra a técnica para a extração de DNA das espécies de micróbios residentes no intestino posterior de cupins. A preparação de uma lâmina de montagem molhada, o que é útil para visualizar a comunidade microbiana do intestino também é ilustrado, e um tour pela espécie ambiente rico intestino é dado.

Extração de DNA a partir do Micróbios Gut da térmita (Zootermopsis Angusticollis) e Visualizing micróbios do intestino

Aprenda a desenvolver organoides intestinais suínos bidimensionais que refletem propriedades fisiológicas do intestino nativo. Este modelo inovador utiliza câmaras de Ussing e medições de TEER para estudar características de transporte em tempo real, oferecendo uma alternativa promissora aos experimentos animais clássicos em pesquisa gastrointestinal.

Organoides intestinais suínos bidimensionais refletindo as propriedades fisiológicas do intestino nativo

Explorar mais vídeos