Metodologia aprimorada para administração de líquido ao pulmão de camundongo: intubação usando um otoscópio de consumidor

[Locutor] Metodologia aprimorada para entrega de líquido ao pulmão do camundongo. Intubação usando um otoscópio de consumo. Todos os procedimentos em animais e este conteúdo foram revisados pelo Departamento de Medicina Comparada da Universidade de Tulane e são aprovados no Protocolo 1810. Busque a aprovação da IACUC e consulte a equipe veterinária de sua instituição antes de continuar. O desenvolvimento de novas terapias pulmonares depende da entrega confiável e repetível ao pulmão do camundongo, mas tradicionalmente depende da administração intranasal, aspiração orofaríngea por língua cheia ou corte cirúrgico. O método a seguir reduziu a variabilidade em comparação com a língua cheia, permitindo coortes menores de animais. Também é muito menos invasivo do que o corte. Procedimento, etapa um, configuração. O kit de intubação de roedores inicialmente usava navios com cunhas de segurança de intubação. Estas são pequenas mangas cônicas que se encaixam sobre um cateter flexível de calibre 20 e uma polegada. Eles evitam que o cateter danifique a carina. Limpe uma cunha de segurança com uma almofada de preparação de isopropanol antes de usá-la. Deslize a cunha de segurança limpa, verde aqui, na cânula flexível de calibre 20. Reúna as outras ferramentas necessárias, incluindo um otoscópio comercial, telefone celular, suporte de mouse com cone de nariz, pinça dobrada e finamente serrilhada, o tubo endotraqueal e a luz de fibra óptica, se estiver usando. Limpe tudo isso com uma almofada de preparação de isopropanol antes de usar. Pegue um comprimento de aproximadamente 20 centímetros de tubo flexível. Dobre-o em forma de U e adicione uma conexão de trava de isca em uma extremidade. Prenda a forma de U com um laço de torção. Adicione dois a 300 microlitros de água filtrada estéril ou tinta nanquim ao tubo. Doravante, este conjunto é referido como um tubo de bolha. Faça um laço de sutura amarrando 13 centímetros de sutura de seda com classificação zero em um círculo. Coloque este laço na parte superior do suporte do mouse e certifique-se de que ambos os lados da sutura estejam bem presos. Coloque o suporte do mouse em cima da base da luz de aumento de metal. Posicione as mãos amigas ao redor de onde estará a boca do mouse. Coloque um mouse na câmara de indução. Use oxigênio de vazão constante a 0,8 litros por minuto e isoflurano a 2%. Anestesiar o mouse o suficiente para não despertar durante a colocação do cone do nariz. Não suprima significativamente a frequência respiratória do camundongo. Respirações regulares ajudam na apreciação das pregas vocais. Conecte o otoscópio ao celular e certifique-se de que a transmissão de vídeo esteja estável. Cuidado, para minimizar a exposição ao isofluorano do pesquisador durante este procedimento, use um respirador químico se estiver realizando várias intubações ou treinamento neste método. Alternativamente, conduza o procedimento em algumas madeiras. Etapa dois, encenação animal. Retire o primeiro animal da câmara de indução assim que ele estiver dormindo. Raspe-os e coloque os dentes superiores no comprimento da sutura. Aplique uma leve tensão no animal para manter o posicionamento da sutura enquanto coloca o mouse de volta no suporte. Ajuste o ângulo do pescoço ligeiramente para trás, colocando o pescoço em uma extensão menor de cinco a 15 graus. Empurre suavemente o cone do nariz sobre as narinas. Não empurre o cone do nariz para baixo com firmeza, pois isso pode interferir na sutura que suspende o mouse. Usando uma pinça dobrada grande e finamente serrilhada, segure firmemente a língua o mais próximo possível do lábio inferior. Puxe-o firmemente para baixo e para longe dos dentes superiores e para o lado dos dentes inferiores. Cuidado, tração prolongada, tensão excessiva ou esmagamento da língua podem comprometer a saúde animal. Monitore os sinais de trauma, incluindo hematomas, sangramento, inchaço ou dessecação da língua. Se algum for observado, aborte o procedimento e alerte a equipe veterinária. Se estiver usando mãos amigas, apoie a pinça nesta posição. Alimente a luz de fibra óptica se estiver usando através do cateter flexível com a cunha de segurança de intubação no lugar. Etapa três, apreciação visual das cordas vocais e intubação. Com o otoscópio na mão não dominante, pressione levemente a língua. Em seguida, incline a câmera e sua fonte de luz para visualizar as cordas vocais perto da base da língua. Devido a pequenas variações na anatomia e na cor do tecido, use o movimento associado à respiração para confirmar a identificação estrutural. Ao começar, orientar-se no feed de vídeo pode ser difícil. Estas são as pregas vocais falsas. Estas são as verdadeiras cordas vocais. Este é o reflexo do tecido bucal. Esta é a sonda e a luz de fibra óptica. Esta é a epiglote. Este é o palato mole. Esta é a rima glottidis, seu alvo para intubação. Este é o lábio do otoscópio, deprimindo a língua. Esta é a região proibida. Com a luz de fibra óptica acesa, se estiver usando, alimente a cânula ao lado do otoscópio, fazendo um leve contato com a base da língua ou a parte labial do otoscópio. Para referência, ajuste o ângulo de abordagem para que o cateter seja muito raso. Imediatamente após a inserção do cateter, menos de um milímetro além das pregas vocais, levante a ponta do cateter de forma que fique quase paralela ao topo da bancada. Isso evita que a epiglote force o cateter dorsalmente para dentro do esôfago. Observe que quase não deve haver resistência ao avançar o cateter. Se houver resistência, remova imediatamente o cateter e permita que as respirações voltem ao normal. Se for observada sangramento, consulte a equipe veterinária. Etapa quatro, confirmação da colocação do tubo endotraqueal. Além da confirmação visual de que o tubo está no local correto usando o otoscópio, a traqueia oferece menos resistência durante a colocação do que o esôfago. A profundidade de inserção óptica é de cerca de cinco milímetros além das pregas vocais. A luz pode ser vista através do pescoço como um método secundário de confirmar que a profundidade de inserção é apropriada. Observe que a cunha de segurança da intubação deve evitar profundidade excessiva na colocação do tubo endotraqueal. A cunha de segurança evitará traumas na corina, mas não precisa impedir o avanço. Em seguida, enquanto segura o tubo endotraqueal no lugar, remova a luz de fibra óptica. Confirme a colocação apropriada do cateter usando o método do tubo de bolha. Prenda o tubo de bolha no lugar usando a trava inferior. O volume corrente deve ser imediatamente aparente. Caso contrário, o tubo endotraqueal está mal colocado. Remova-o rapidamente e permita que a frequência respiratória normal do camundongo retorne. Etapa cinco, parto intratraqueal. Muito parecido com o método de puxar a língua para parto orofaríngeo, o parto por intubação corre o risco de afogar o animal. Em camundongos adolescentes e adultos, 50 microlitros é um volume geralmente seguro de fluido para fornecer e é suficiente para se espalhar pelos pulmões. Se estiver usando uma pipeta para administração, pipete o volume desejado diretamente no cateter e deixe o camundongo inalar a solução. Para garantir a entrega difusa aos pulmões, além do líquido fornecido aos pulmões com até 500 microlitros de ar. Se desejado, múltiplas depressões do pipeter podem ser conduzidas sem risco de aspiração negativa do líquido fornecido. Observe que o uso de mais do que o volume corrente, aproximadamente 200 microlitros, pode ser necessário ao lavar o inóculo com ar. No entanto, o uso de 500 microlitros não corre o risco de trauma, pois é apenas cerca de metade da capacidade vital. Etapa seis, avaliação da entrega. Uma luz de fibra óptica portátil pode ser feita de componentes baratos e facilmente obtidos. Um conjunto de fibra óptica comercial, como mostrado aqui, pode ser usado. No entanto, uma tampa de tubo cônico de 50 ml com um orifício perfurado usando uma agulha de calibre 20 através da qual um cabo de fibra óptica de plástico de 75 milímetros é alimentado é suficiente. Dispositivos comerciais e artesanais foram usados neste vídeo. Resultados representativos, o parto intratraqueal por intubação resulta em melhor parto e redução da variabilidade quando comparado à aspiração orofaríngea por puxão de língua. Comparação direta da tração da língua e da intubação guiada. Três investigadores diferentes com níveis de experiência enterrados ou solicitados a entregar independentemente 50 microlitros de tinta da China diluída por via orofaríngea por puxão de língua a camundongos C57 BL / 6J de 10 a 12 semanas de idade de ambos os sexos. Dois pesquisadores também entregaram o mesmo estoque e volume de tinta ao pulmão por meio de intubação, conforme descrito. Os pulmões foram removidos logo após o parto e fotografados com aumento de 2x. As fotografias foram avaliadas quanto à área corada por um pesquisador cego independente usando a Imagem J. Ela descobriu que mais área pulmonar era corada se a intubação fosse usada. Além disso, a variabilidade, expressa como desvio percentual da média, foi reduzida se o parto intratraqueal após a intubação foi usado em vez de puxar a língua. Esta estação usada para intubação guiada é preparada conforme mostrado. A partir da esquerda, pipetas para parto, tubo de bolha para confirmação da colocação adequada do tubo endotraqueal, fórceps, espátula, espéculo nasal pediátrico, mãos amigas, luz de aumento, suporte de mouse com cone nasal, sonda de fibra óptica e câmara de indução anestésica. A intubação produz maior entrega ao pulmão com menos variabilidade em relação à aspiração do PO. Camundongos fêmeas com 10 semanas de idade foram administrados com uma vez 10 elevado ao 11º VG de AIV 6.2 luciferase e avaliados com imagens bioluminescentes in vivo sete dias depois. 10 minutos antes da imagem, eles foram injetados por via subcutânea com luciferina. Imagens representativas de camundongos recebendo luciferase AV 6.2 por aspiração OP após puxão da língua ou instalação intratraqueal por intubação são mostradas. A aspiração orofaríngea por puxão da língua levou à distribuição do sinal em várias partes da via aérea superior, enquanto a intubação levou ao sinal concentrado no pulmão. As regiões de interesse são a mesma área e a radiância média dentro da região é mostrada na imagem. A quantificação dos sinais de luciferase revelou melhor eficiência de entrega aos pulmões por intubação e enfatizou ainda mais a variabilidade reduzida na entrega usando esse método. Conclusão, como visto nas figuras anteriores, a inoculação interpulmonar usando o método tradicional de puxar a língua mostra distribuição irregular e inconsistente do inóculo e maior variabilidade na quantidade que atinge os pulmões. Em contraste, o método de intubação levou a uma entrega mais consistente nos pulmões direito e esquerdo e foi menos variável. Os resultados positivos robustamente demonstrados deste método de intubação são, um, instalação replicável de até 50 microlitros nos pulmões do camundongo, dois, distribuição difusa de líquido instilado pelos pulmões e três, disseminação reduzida do inóculo além dos pulmões. Este método é rápido, seguro e pode ser incorporado em procedimentos laboratoriais sem equipamentos caros ou treinamento demorado.