Name: Separação e Fracionamento de Proteínas de Filtrado de Cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Aprenda a separar e fracionar proteínas de filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis usando focagem isoelétrica e SDS-PAGE. Este método ajuda a identificar frações imunogênicas para diagnósticos e vacinas.

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<ol><li>Gomez, M., Johnson, S., Gennaro, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+secreted+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis+by+a+bioinformatic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis by a bioinformatic approach.</a> Infect Immun. 68 (4), 2323-2327 (2000).</li>
<li>de Souza, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-accuracy+mass+spectrometry+analysis+as+a+tool+to+verify+and+improve+gene+annotation+using+Mycobacterium+tuberculosis+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation using Mycobacterium tuberculosis as an example.</a> BMC Genomics. 9, 316(2008).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (5), 574-586 (2001).</li>
<li>Tucci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+proteomic+and+glycoproteomic+profiling+of+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrative proteomic and glycoproteomic profiling of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> PLoS One. 15 (3), e0221837(2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoproteomic+identification+of+human+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis+that+differentiate+healthy+contacts+from+tuberculosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoproteomic identification of human T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (3), 538-549 (2010).</li>
<li>Yasuda, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cytokine+profiles+related+to+Mycobacterium+tuberculosis+latent+antigens+using+a+whole-blood+assay+in+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cytokine profiles related to Mycobacterium tuberculosis latent antigens using a whole-blood assay in the Philippines.</a> Front Immunol. 15, 1330796(2024).</li>
<li>Målen, H., Søfteland, T., Wiker, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+H37Rv+culture+filtrate+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins.</a> Scand J Immunol. 67 (3), 245-252 (2008).</li>
<li>Bekmurzayeva, A., Sypabekova, M., Kanayeva, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis+diagnosis+using+immunodominant%2C+secreted+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis diagnosis using immunodominant, secreted antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Tuberculosis (Edinb). 93 (4), 381-388 (2013).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Mustafa, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+biological+characterization+of+Mycobacterium+tuberculosis-specific+ESAT6-like+proteins+and+their+potentials+in+the+prevention+of+tuberculosis+and+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Chemical and biological characterization of Mycobacterium tuberculosis-specific ESAT6-like proteins and their potentials in the prevention of tuberculosis and asthma.</a> Med Princ Pract. 32 (4-5), 217-224 (2023).</li>
<li>Rosenkrands, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis.</a> Electrophoresis. 21 (17), 3740-3756 (2000).</li>
<li>Jungblut, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteome+analysis+of+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+bovis+BCG+strains%3A+Towards+functional+genomics+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteome analysis of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis BCG strains: Towards functional genomics of microbial pathogens.</a> Mol Microbiol. 33 (6), 1103-1117 (1999).</li>
<li>Lim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+new+T-cell-stimulating+antigens+from+Mycobacterium+tuberculosis+culture+filtrate%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of the new T-cell-stimulating antigens from Mycobacterium tuberculosis culture filtrate.</a> FEMS Microbiol Lett. 232 (1), 51-59 (2004).</li>
<li>Rodríguez-Hernández, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+antigenic+biomarkers+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Zhejiang+Univ+Sci+B%22%5BJournal%5D)">Application of antigenic biomarkers for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Zhejiang Univ Sci B. 21 (11), 856-870 (2020).</li>
<li>Deenadayalan, A., Sundaramurthi, J. C., Raja, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+proteomic+analysis+of+preparative+isoelectric-focusing+separated+culture+filtrate+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Immunological and proteomic analysis of preparative isoelectric-focusing separated culture filtrate antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Exp Mol Pathol. 88 (1), 156-162 (2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&Auml; Sistema de filtragem de fluxo tangencial de fluxo KTA&nbsp;</td><td>CYTIVA</td><td>29038437</td><td></td></tr><tr><td>Anfólitos (pH 3,0 a 10,0)</td><td>BIO-RAD</td><td>1632094</td><td></td></tr><tr><td>Anfólitos (pH 4,0 a 6,0)</td><td>BIO-RAD</td><td>1631143</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio de proteína BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>71285-M</td><td></td></tr><tr><td>CAPS</td><td>MERCK</td><td>C2632</td><td></td></tr><tr><td>Hidrolisado de caseína</td><td>MERCK</td><td>65072-00-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico</td><td>MERCK</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>MERCK</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>MERCK</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de amônio férrico</td><td>HIMÍDIA</td><td>GRM10944</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Inclinações de Lowenstein-Jensen&nbsp;</td><td>HIMÍDIA</td><td>SL001</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio</td><td>MERCK</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Filtração a Vácuo de Liberação Rápida Millipore Stericup</td><td>MERCK</td><td>S2HVU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>695017</td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenoortofosfato de potássio</td><td>MERCK</td><td>Pág. 0662</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>MERCK</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Célula IEF Preparativa (Rotofor)&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de sódio</td><td>MERCK</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>HIMÍDIA</td><td>MB095</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MERCK</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Ureia</td><td>MERCK</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Aparelho de Gel Eluter Inteiro&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

separação e fracionamento de proteínas de filtrado de cultura (cfps) de mycobacterium tuberculosis

Separation and Fractionation of Culture Filtrate Proteins (CFPs) from Mycobacterium tuberculosis

A Figura 1 ilustra a complexidade das proteínas filtradas de cultura (CFP) preparadas. Inicialmente, 100 μg de CFP foram submetidos à análise 2D-SDS PAGE para avaliar sua complexidade. Essa análise revelou a presença de quase 100 manchas proteicas distintas na CFP (Figura 1).
As 20 frações coletadas de cada corrida foram analisadas por SDS-PAGE. Destes, três frações representativas de três ensaios diferentes são mostradas na <strong c...

Separação e Fracionamento de Proteínas de Filtrado de Cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

Secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) play a crucial role in tuberculosis pathogenesis, immune modulation, and disease ...

separation-fractionation-culture-filtrate-proteins-cfps-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas ao ferro. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o isolamento gradual de vesículas extracelulares (EVs) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas sob condições limitantes de ferro que imitam o ambiente hospedeiro. Ele descreve o uso de ultrafiltração, centrifugação diferencial e separação de gradiente de densidade para enriquecer e identificar frações contendo...

Isolamento de vesículas extracelulares contendo sideróforo de Mycobacterium tuberculosis

Este vídeo demonstra a separação de ácidos micólicos baseada em cromatografia em camada fina. Essa técnica separa os diferentes ácidos micólicos - lipídios de cadeia longa presentes na parede celular das micobactérias - com base em sua polaridade.

Separação baseada em cromatografia em camada fina de variantes de ácido micólico: um método para separar lipídios da parede celular micobacteriana com base na polaridade

Este vídeo demonstra o isolamento e a concentração de proteínas filtradas de cultura bacteriana, que incluem vesículas extracelulares bacterianas, usando ultrafiltração. As vesículas extracelulares concentradas servem como marcadores diagnósticos para a detecção de doenças.

Concentração de proteína de filtrado de cultura bacteriana usando um dispositivo de ultrafiltração

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para purificar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A técnica utiliza uma coluna porosa embalada com resina para obter frações purificadas de EVs. As partículas porosas permitem seletivamente que proteínas menores entrem nos poros, resultando em eluição mais lenta. Ao mesmo tempo, os EVs são excluídos de entrar nos poros devido ao seu tamanho maior e são...

Uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

O objetivo é fracionar e isolar pequenas moléculas bioativas, peptídeos de um complexo extrato vegetal e proteínas de micróbios patogênicos, empregando o método de focalização isoelétrica de fase líquida (IEF). Além disso, as moléculas separadas foram identificadas e sua bioatividade confirmada.

Separação de Pequenas Moléculas Bioativas, Peptídeos de Fontes Naturais e Proteínas de Micróbios pelo Método De Foco Isoelétrico Preparatório (IEF)

A quantificação rápida e eficiente do crescimento intracelular do M. tuberculosis é crucial para a busca de terapias melhoradas contra a tuberculose (TB). Este protocolo descreve um ensaio de detecção colorimétrica baseado em caldo usando um sistema automatizado de cultura líquida para quantificar o crescimento de Mtb em macrófagos tratados com terapias candidatas dirigidas ao hospedeiro.

Um Sistema de Cultura Automatizado para Uso em Testes Pré-Clínicos de Terapias Dirigidas ao Hospedeiro para Tuberculose

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Este protocolo descreve a cromatografia de exclusão de tamanho, uma técnica fácil e reprodutível para enriquecer as vesículas extracelulares mycobacterium tuberculosis de supernascedores culturais.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimento de vesícula extracelular através da cromatografia de exclusão de tamanho

Este protocolo detalha o enriquecimento de vesículas extracelulares de micobactérias nativas (mEVs) de culturas axênicas de Mycobacterium smegmatis (Msm) e como mCherry (um repórter fluorescente vermelho) contendo MsmEVs recombinantes pode ser projetado e enriquecido. Por fim, verifica-se a nova abordagem com o enriquecimento de MsmEVs contendo a proteína EsxA do Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimento de vesículas extracelulares nativas e recombinantes de micobactérias

Aqui, demonstramos a preparação do filtrado de cultura Mtb (CF), que é o meio de crescimento bacteriano que consiste em proteínas secretadas pela bactéria. O Mtb secreta proteínas para modular a sinalização do hospedeiro e a resposta imune, que são cruciais para a patogênese. Os FCs preparados são analisados por espectrometria de massas para identificar todos os fatores secretores.

Preparação do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis para entender a patogênese da TB

Este protocolo separa proteínas insolúveis da parede celular e da membrana em frações simples (1-5 proteínas) usando focalização isoelétrica preparativa (IEF) com base no ponto isoelétrico, seguido de separação por peso molecular. As frações resultantes podem ser usadas diretamente para análises imunológicas e proteômicas sem purificação adicional.

Separação e Fracionamento de Proteínas da Parede Celular e da Membrana Celular de Mycobacterium tuberculosis para Análise de Proteínas a Jusante

Aprenda a separar e fracionar proteínas de filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis usando focagem isoelétrica e SDS-PAGE. Este método ajuda a identificar frações imunogênicas para diagnósticos e vacinas.

Separação e Fracionamento de Proteínas de Filtrado de Cultura (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

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