Separação e Fracionamento de Proteínas da Parede Celular e da Membrana Celular de Mycobacterium tuberculosis para Análise de Proteínas a Jusante

Nossa pesquisa se concentrou no desenvolvimento de um método simplificado para separar proteínas insolúveis da parede celular e da membrana celular de Mycobacterium tuberculosis em frações simples para ensaios proteômicos e imunológicos diretos. Os avanços nas técnicas eletroforéticas agora permitem que proteínas complexas sejam separadas em menos frações de proteína, facilitando o isolamento eficiente baseado em espectrometria de massa para aplicações proteômicas e imunológicas funcionais. Os principais desafios incluem baixa solubilidade da proteína hidrofóbica precipitando acima de cem miligramas e desnaturação induzida por SDS-PAGE, o que dificulta a aplicação a jusante que precisa de confirmação nativa, como ensaios de atividade enzimática.

Nenhum protocolo atual separa sistematicamente as proteínas hidrofóbicas insolúveis da parede celular e da membrana celular em frações solúveis em água definidas para análise proteômica e imunológica direta, o que é fundamental para entender a função e orientar as intervenções. Nossa pesquisa futura se concentrará no desenvolvimento de diagnósticos baseados em antígenos de células T e na avaliação de sua sensibilidade, especificidade e desempenho em toda a população de TB para uma detecção precoce e precisa da TB com o objetivo de apoiar um melhor controle da doença. Para começar, obtenha a parede celular, membrana celular e amostras de proteína citosólica do lisado de células inteiras do bacilo Mycobacterium tuberculosis.

Solubilize as proteínas da parede celular e da membrana celular em tampão de foco isoelétrico. Adicione 2% de anfólitos entre as faixas de pH de 3 a 10 e 4 a 6 em uma proporção de um para quatro. Agora fracione as proteínas solubilizadas em um sistema de foco isoelétrico líquido mantido a quatro graus Celsius com um banho de água de resfriamento.

Realize a separação de foco isoelétrico seguindo as instruções do fabricante, aplicando uma potência constante de 12 watts. Recolha as fracções individuais de focagem isoeléctrica com uma bomba de vácuo. Determine os valores de pH de cada fração.

Submeta 50 microgramas das frações separadas ao SDS-PAGE e visualize as proteínas usando a coloração Coomassie Brilliant Blue ou prata. Comece misturando as frações de parede celular e membrana celular separadas por IEF com tampão de amostra de eletroforese em gel SDS. Aqueça a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos.

Separe as frações de proteína na segunda dimensão, usando géis de poliacrilamida de 16 por 20 centímetros com um gel de resolução de 12,5% e um gel de empilhamento de 4%. Em seguida, use um único poço de amostra de 13 centímetros de comprimento para carregar a amostra no gel. Realize eletroforese a uma corrente constante de 50 miliamperes por gel até que a frente do corante atinja o fundo do gel.

Após eletroforese, equilibre o gel em tampão de eluição por 10 minutos. Transfira o gel para um aparelho de gel eluidor inteiro de acordo com as instruções do fabricante do instrumento. Execute o eluidor a uma corrente constante de 250 miliamperes por uma hora para eluir as proteínas do gel e, em seguida, use uma bomba de vácuo para coletar aproximadamente 30 frações de proteína, cada uma medindo três mililitros, do gel.

Quantificar a concentração de proteínas nas fracções eluídas utilizando o ensaio de proteínas do ácido bicinconínico. Submeta 10 microgramas das frações de proteína eluídas à análise SDS-PAGE e visualize as bandas pela coloração Coomassie Brilliant Blue. Padrões distintos de bandas proteicas foram observados nas primeiras frações sobrenadante: parede celular, membrana celular e citosol de Mycobacterium tuberculosis, confirmando o fracionamento subcelular bem-sucedido.

O foco isoelétrico das proteínas da parede celular apresentou a maior concentração de proteínas nas frações com pH abaixo de 2,5. SDS-PAGE das frações IEF da parede celular revelou bandas proteicas distintas, predominantemente nas frações 1 a 8. A separação de proteínas da membrana celular por IEF revelou maiores picos de concentração de proteínas entre pH 4 e pH 10, com a maior concentração ocorrendo em torno de pH 10.

SDS-PAGE das frações IEF da membrana celular apresentou diversos perfis proteicos com bandas mais claras nas Frações 1 a 9. A separação preparativa SDS-PAGE das proteínas da parede celular resolvidas por IEF produziu frações predominantemente abaixo de 100 microgramas por mililitro. SDS-PAGE das frações proteicas da parede celular eluída exibiu uma ampla gama de pesos moleculares proteicos, com bandas mais concentradas nas frações 6 a 10.

O SDS-PAGE preparativo de frações de proteínas da membrana celular revelou que mais da metade das frações tinha concentrações de proteínas entre 50 e 199 microgramas por mililitro. SDS-PAGE das frações proteicas da membrana celular eluída revelou bandas concentradas nas pistas 1 a 8 e 13 a 16.