In situ Isolamento e Cultura de Bactérias Recalcitrantes do Solo usando um Chip de Isolamento (iChip)

Existem repositórios ricos de micróbios em diversos ambientes naturais, como solo, corpos d'água e ambientes extremos. No entanto, explorar essa enorme biodiversidade é amplamente limitado por métodos e meios de laboratório. Ao ultrapassar essa barreira cultural e explorar essa biodiversidade, tem o potencial de atender a várias necessidades biotecnológicas, bem como resolver desafios globais.

Por exemplo, o desenvolvimento da resistência antimicrobiana tornou-se definido para a saúde pública global. Bactérias do solo que são difíceis de cultivar em laboratório podem produzir novos compostos bioativos com potente atividade antimicrobiana que podem ser valiosos para enfrentar o desafio global dos sistemas antimicrobianos. A enorme variedade de micróbios ambientais e seus produtos não foram explorados, pois as tecnologias tradicionais baseadas em cultura de laboratório geralmente levam ao isolamento de micróbios conhecidos semelhantes. O objetivo deste experimento é demonstrar a cultura de alto rendimento de bactérias recalcitrantes do solo in-situ usando a tecnologia IChip. Neste protocolo, demonstraremos a construção e o uso desta tecnologia IChip que pode ser usada para cultivo in-situ de alto rendimento de bactérias difíceis de cultivar e recuperação de bactérias produtoras de antimicrobianos como uma aplicação desta tecnologia.

[Apresentador] Para começar, crie um projeto preliminar das placas superior, inferior e intermediária do chip de isolamento em um software de apresentação. Use a opção de inserção de forma no software de apresentação para inserir círculos de dimensões necessárias para servir como IChip. Insira círculos menores para representar os canais IChip. Organize os círculos menores no padrão desejado para preparar um projeto preliminar para a placa superior, inferior e intermediária do IChip. Selecione o design e use o menu do botão direito para salvar o design preliminar como uma imagem. Usando o projeto preliminar como modelo, comece a criar um projeto bidimensional usando um software de projeto auxiliado por computador. No menu de esboço, insira formas predefinidas, predominantemente círculos para criar o design básico para as placas IChip e a área dos canais. Use a opção de dimensão para definir as dimensões reais das placas e canais. Clique em OK para finalizar o projeto e, em seguida, use a função de extrusão para converter o projeto 2D em um modelo 3D da espessura desejada. Por fim, use o menu de arquivo para salvar uma cópia do modelo 3D no formato de arquivo de litografia estática compatível com impressão 3D.

[Apresentador] Colete todos os itens essenciais que serão necessários para a coleta de amostras de solo e chegue ao local de onde a amostra será coletada. Abra o aplicativo móvel de geocodificação e encontre o endereço exclusivo de três palavras do local de amostragem e registre-o. Em seguida, registre os metadados relevantes da amostra, como temperatura, data, hora, profundidade da amostragem, clima e exposição do local aos elementos. Pulverize uma pá e a caixa de poliestireno na qual o IChip será plantado com etanol a 70%. Limpe-os com papel de seda e deixe o etanol secar completamente ao ar. Em seguida, use a pá descontaminada para limpar quaisquer detritos da superfície, como serapilheira ou rochas para expor a camada superior do solo. Descontamine a pá novamente como antes. Usando a pá, acesse o solo a uma profundidade de três a seis, ingira subsuperfície e transfira cerca de quatro a cinco kg de solo de uma profundidade uniforme para a caixa de poliestireno. A caixa deve estar aproximadamente 75% cheia. Transporte o solo coletado de volta ao laboratório imediatamente. A partir da amostra de solo coletada, pese um grama de solo livre de detritos, rochas e serapilheira, em um tubo de centrífuga estéril de 50 mil contendo 10 ml de solução salina estéril. Misture o solo com a solução salina enquanto vórtice por cerca de 10 segundos para criar uma pasta de solo. Deixe o tubo da centrífuga intacto por cinco minutos para permitir que as grandes partículas de sujeira no tubo se assentem. Em seguida, transfira cuidadosamente a suspensão de solo sobrenadante para um novo tubo de ensaio rotulado como S. Usando a suspensão de solo como amostra não diluída, execute a diluição zero transferindo um ml da amostra para nove ml de solução salina estéril em um tubo novo. Prepare a diluição de 10 é a potência menos um a 10 é a potência menos cinco. Dentro de um gabinete de biossegurança, a superfície descontamina a placa superior, a placa inferior e a placa intermediária do IChip por imersão em etanol a 70% por 10 minutos. Enxágue o excesso de etanol lavando os componentes do IChip com água desionizada estéril e deixe-os secar ao ar uma placa de Petri estéril. Coloque a placa do meio do IChip em uma placa de Petri estéril pronta para a semeadura. Derreta o meio de ágar SMS no micro-ondas. Deixe esfriar e, em seguida, transfira 22,5 ml de ágar SMS a 45 graus para um tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Para isso, adicione 2,5 ml de uma diluição apropriada da amostra de solo e misture bem por inversão suave, evitando a introdução de bolhas de ar. Despeje lentamente cerca de três a quatro ml do meio de ágar SMS semeado sobre a placa intermediária do IChip cobrindo toda a superfície. Em seguida, deixe o meio de ágar SMS endurecer por cerca de cinco a 10 minutos. Verifique se o meio de ágar SMS está definido. Em seguida, com a lâmina de barbear estéril, raspe o excesso de ágar SMS da superfície da placa de metal IChip, deixando para trás os plugues de ágar nas câmaras de difusão individuais. Depois de remover a folha protetora de um dos filtros de membrana de policarbonato de 0,03 micrômetro, coloque-a cuidadosamente na parte interna da lâmina superior do IChip usando uma pinça estéril. Em seguida, coloque outro filtro de membrana de policarbonato de 0,03 micrômetro no lado exposto da placa de metal semeada usando uma pinça estéril. Coloque as placas superior e inferior do IChip, imprensando a placa do meio e as membranas de policarbonato, tendo o cuidado de alinhar esses orifícios de parafuso em todas as placas para completar a montagem do IChip. Aperte firmemente as porcas e parafusos para prender o conjunto IChip. Crie uma depressão maior que o tamanho do IChip no coletor de solo na caixa de poliestireno usando uma pá estéril. Plante o conjunto IChip verticalmente dentro da depressão e embale com terra firmemente, garantindo que todas as superfícies do IChip estejam completamente cobertas. Em seguida, deixe a cultura in situ pela duração desejada de duas a quatro semanas. Durante a incubação, use água destilada estéril para umedecer o ambiente do solo, o IChip plantado, periodicamente para evitar que os plugues de ágar SMS semeados na câmara de difusão sequem. Após a incubação desejada, desaloje suavemente o solo ao redor do IChip plantado para recuperá-lo. Em seguida, lave o IChip com solução salina estéril para remover as partículas de sujeira aderentes e transfira-o para dentro de um gabinete de biossegurança para processamento posterior. Desaperte as porcas e o parafuso do conjunto do IChip e desmonte cuidadosamente o IChip. Usando uma pinça estéril, remova as membranas de policarbonato e transfira a placa intermediária do IChip para a placa de Petri preparada. Use aplicador de madeira estéril para recuperar os tampões de ágar individuais dentro de cada câmara de difusão. Inocule os plugues de ágar em meios apropriados, como ágar SMS ou ágar caldo de soja tríptico 0,1X para tentar o cultivo em laboratório. Os isolados cultivados podem então ser rastreados para produção antimicrobiana por métodos de rotina, como a sobreposição de ágar usando cepas de teste. Aqui mostramos resultados de triagem representativos para 12 culturas, IC-1 a 12 obtidas de tampões de ágar IChip contra Staphylococcus aureus ATCC 29213 e Acinetobacter baumannii B8342. Observe que as culturas IC-6 e IC-8 mostram atividade contra cepas de testadores gram-positivas e gram-negativas, respectivamente. Alternativamente, pinte e visualize os tampões de ágar recuperados contendo bactérias recalcitrantes do solo cultivadas in situ para confirmar o crescimento de microcolônias em condições in-situ. Usando essa abordagem, é possível recuperar bactérias recalcitrantes do solo in situ de maneira de alto rendimento. O IChip impresso em 3D pode acomodar 156 plugues de ágar. No entanto, é necessário escolher a diluição correta durante a semeadura para garantir que uma célula bacteriana seja semeada em cada canal do IChip. As bactérias necessárias podem então ser rastreadas quanto às bioatividades desejadas, como produção de metabólitos, produção de enzimas, produção de biopolímeros, etc., se puderem ser cultivadas em condições de laboratório. No entanto, também é provável que algumas bactérias não cresçam em condições de laboratório e, nesses casos, podemos ter que adotar abordagens metagenômicas para perceber a presença microbiana e acessar seu potencial biossintético. O método descrito é muito fácil e pode ser facilmente usado para bioprospecção de micróbios em diversas condições ambientais com pequenas modificações.