Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2

Para entender melhor o membro em crescimento, estudamos o cílio primário, uma organela que desempenha um papel fundamental na regulação da resposta das células ao seu ambiente. Para investigar o papel do cílio no crescimento, estamos imaginando-os dentro da placa de crescimento, uma camada de cartilagem onde o novo osso cresce. O cílio primário é extremamente pequeno, com menos de cinco micrômetros de comprimento, o que o torna difícil de visualizar, principalmente em três dimensões.

Imaginá-lo dentro de tecidos parcialmente calcificados ricos em matriz, como cartilagem e osso, só torna ainda mais difícil explorar com precisão sua presença, sem falar na posição, orientação e tamanho. Podemos mapear a organização 3D dos cílios primários em todas as células dentro da placa de crescimento, perguntando se as células doentes montam uma onde e como ela é orientada em relação à morfogênese do tecido. Os cílios primários foram estudados anteriormente apenas em 2D em placas de crescimento ou em números muito pequenos.

Os sinais fluorescentes endógenos para o cílio e centríolos trazem confiança na identificação ciliar devido ao alto sinal ao ruído e evitam a necessidade de imuno-histoquímica. Este protocolo também permite imagens coletivas de alto rendimento de centenas de cílios no tecido, permitindo-nos relacionar espacialmente os cílios com os eventos de morfogênese que estamos estudando. Esta metodologia de imagem e análise pode ser aplicada a outros tecidos para mapear os cílios primários em tecidos e órgãos.

Isso permitirá uma maior compreensão da ligação entre a estrutura e a função dos cílios primários. Para começar, pegue a seção criogênica congelada preparada do tecido do camundongo e coloque a lâmina horizontalmente em temperatura ambiente para descongelar. Lave a lâmina usando uma gota de PBS por três ciclos de cinco minutos cada para remover a farsa.

Aplique a solução de DAPI a 10 micromolares na lâmina e manche durante um minuto. Em seguida, monte a amostra, cubra-a com uma lamínula e deixe-a em temperatura ambiente durante a noite. Sele as bordas da lamínula usando selante de lamínula.

Para configurar o microscópio confocal, ligue-o, abra o software e clique no botão Sistema. Na guia Aquisição, clique em Configuração inteligente para configurar os canais e adicionar os canais GFP, mCherry e DAPI. Em seguida, selecione a opção ARI Scan e a função sR8-Y no triângulo de varredura ARI entre resolução e velocidade.

Clique em Melhor Sinal e depois em OK para confirmar. Na guia Localizar em Controle do microscópio, selecione a objetiva 40 vezes e 1,4 com imersão em óleo. Em seguida, coloque a corrediça no suporte da corrediça e levante a objetiva até que o óleo toque na lamínula.

Em seguida, posicione a placa de crescimento, ou outra região de interesse, abaixo do caminho da luz. Na guia Localizar, clique em Fluorescência e selecione DAPI. E usando a ocular, mova o suporte deslizante com o joystick para posicionar a placa de crescimento, ou região de interesse, sob o campo de visão.

Na guia Aquisição, selecione apenas o canal DAPI. Clique em Contínuo para view a imagem do canal DAPI na tela e certifique-se de que a placa de crescimento esteja visível. Para abrir o visualizador de blocos, clique em Mostrar Visualizador na guia Blocos.

Adicione o número necessário de blocos, normalmente um bloco na direção X e três a cinco blocos na direção Y. Em seguida, clique em Visualizar e Iniciar. Agora verifique se os ladrilhos cobrem as três zonas da placa de crescimento, repouso, proliferação e hipertrófica.

Ajuste a posição e o número do ladrilho, se necessário. Para configurar os parâmetros da imagem, na guia Aquisição, clique em Contínuo. Para alinhar o detector de varredura ARI, abra a janela de ajuste do detector de varredura ARI clicando no símbolo de roseta lado a lado na parte inferior.

Espere até que todas as peças fiquem verdes. Na guia Canais, ajuste o ganho mestre e a potência do laser para visualizar claramente os núcleos na tela. Em seguida, selecione todos os três canais e clique em Contínuo para iniciar a geração de imagens.

Permita que o detector de varredura ARI se alinhe. Na guia Modo de aquisição, defina o tamanho da imagem, o tamanho do pixel, o tamanho do quadro, a velocidade e os valores médios. Na guia Aquisição, marque a caixa de seleção Z-Stack para ativar a geração de imagens Z-stack.

Em seguida, selecione apenas o canal DAPI e clique em Contínuo para visualizar a imagem na tela. Mova a objetiva para o plano mais próximo a ser fotografado. Na guia Z-Stack, clique em Definir primeiro plano, concentre-se no último plano a ser visualizado e clique em Definir último plano para configurar o intervalo de imagem.

Defina o intervalo entre os planos da pilha Z para 0,15 micrômetros. Vá para o centro da faixa de imagem da pilha Z. Na guia Blocos, em Regiões de bloco, clique em Verificar e, em seguida, em Definir Z e Mover para Avançar.

Agora, na guia Estratégia de foco, confirme se a estratégia de foco está definida para usar valores Z e superfície de foco definidos na configuração do bloco. Em seguida, clique em Iniciar experimento para iniciar a aquisição da imagem. Para processar as imagens, vá para a guia Processamento, selecione Modo único ou em lote, selecione Processamento de digitalização ARI, marque a opção Processamento 3D e selecione Filtro automático padrão.

Escolha a imagem bruta adquirida e inicie o processamento. Depois de concluir o processamento de verificação de ARI, selecione Costura nos métodos de processamento. Escolha Nova saída, Fusível blocos, Sombreamento correto e Tudo por referência com a referência definida como DAPI.

Selecione a imagem processada de digitalização ARI e inicie o processo de costura. Para começar, importe o arquivo de imagem CZI adquirido para o software e abra o painel Análise. No menu suspenso, selecione Novo pipeline.

Use o botão Adicionar operação para adicionar operadores ao pipeline. Para criar um pipeline de detecção de células, importe a célula após o segmentador Python para o pipeline. Defina o nome do modelo como Cyto 2, o canal de entrada como 2, o segundo canal como 3, o diâmetro em micrômetros como 10.

limite de fluxo para 0,4 e limite de probabilidade da célula para 0. Em seguida, adicione um operador de objetos de documento de importação antes do pipeline e renomeie-o para Importar rótulos manuais. Em seguida, adicione um operador de filtro de recurso de objeto após o pipeline e renomeie-o como Filtro de Tamanho.

Desenhe a região de interesse usando a ferramenta Polígono no primeiro plano e no último plano. Renomeie o objeto criado e marque-o. Clique na seta azul para frente na parte superior do painel Análise para executar o pipeline.

Para criar um pipeline de detecção de cílios e centríolos primários, abra o painel Análise e selecione Novo pipeline no menu suspenso. Adicione e ajuste operadores como objetos de documento de importação, dois operadores de limite, divisão, objeto, recurso, filtro e compartimento para o pipeline. Em seguida, clique na seta azul para frente na parte superior do painel Análise para executar o pipeline.

Abra a janela Objetos, selecione o objeto que contém as células, cílios primários e centríolos, aqui chamados de célula do compartimento, e clique em Importar/Exportar. Selecione Exportar Excel. Escolha os recursos como número de filhos, nome, nomes dos pais, lado curto encadernado orientado em 3D, lado do meio, lado longo, ângulo XY, ângulo XZ, ângulo YZ, caixa delimitadora X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, tamanho X, tamanho Y, tamanho Z, centro da geometria X, Y, Z, primeiro plano, último, contagem, malha, malha de volume e malha de área de superfície para salvar.

A organização dos cílios primários foi mapeada com sucesso na placa de crescimento de um camundongo de seis semanas de idade. A imagem de alta resolução demonstrou a capacidade de visualizar centríolos individuais e cílios primários em seu ambiente tridimensional. Células e cílios primários são detectados em 3D usando o pipeline de análise de imagem, que pode diferenciar os cílios primários apontando para o lado daqueles apontando para trás.