Name: Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Aprenda a mapear cílios primários em 3D na placa de crescimento de camundongos transgênicos ARL13B-CENTRIN-2 usando microscopia confocal. Este método avançado permite analisar a organização e orientação dos cílios em tecidos mineralizados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mm de lamínulas</td><td>fisherscientific&nbsp;</td><td></td><td></td>12373128</tr><tr><td>software arivis Vision4D</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 980 Airyscan 2</td><td></td></tr><tr><td>CoverGrip Selante de lamínula&nbsp;</td><td>Biotium&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>Cryofilm tipo 3C(16UF) (tipo folha) 2.0 cm de largura</td><td>Section-lab</td><td>C-FUF303</td><td>Para ser adquirido diretamente da Section-lab</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td></td><td>Leica CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Base Descartável Moldes&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>software Imaris&nbsp;</td><td>Oxford Instruments&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Software de análise de imagem para reconstrução 3D&nbsp;</td></tr><tr><td>Óleo de Imersão 518F</td><td>Zeiss</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo</td><td>Feather</td><td>02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Glass Antifade Mountant&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Para ser adquirido diretamente da Section-lab</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscópio slides</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Freeware para microscopia de varredura a laser confocal</td></tr></tbody></table>

imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo arl13b-centrin-2

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

A placa de crescimento de camundongos de 6 semanas de idade foi fotografada usando o protocolo descrito e a organização dos cílios primários mapeados no tecido. Uma imagem de todas as três regiões da placa de crescimento - em repouso, proliferativa e hipertrófica - foi capturada e executada no pipeline de análise (Figura 2A). As células individuais podem ser identificadas com a coloração DAPI, com seu axonema ciliar em vermelho e seus centríolos em verde. A resolução usando este método é alta o suficiente para discriminar centríolos individuais (Figura 2B). Nessa resolução, os cílios podem ser visualizados em seu ambiente 3D, apontando em diferentes direções (Vídeo 1).
Imagens de resolução mais baixa, com objetivas de maior ampliação, também podem ser capturadas para visualizar cílios primários em uma região maior de tecido; no entanto, eles não são adequados para análise da orientação dos cílios em 3D. Por exemplo, os cílios primários na cartilagem articular foram fotografados com a objetiva de 20x, demonstrando que o método também funciona em outros tecidos (Figura 2C). Nessa resolução, os axonemas ciliares em vermelho podem ser identificados, mas os centríolos são mais difíceis de discriminar. O osso subcondral tende a apresentar muito sinal de fundo de GFP, dificultando a identificação do centríolo neste tecido.
O pipeline pode detectar células individuais, cílios primários e centríolos, e funciona para placas de crescimento jovens altamente organizadas e placas de crescimento mais velhas, onde as colunas são menos bem definidas, como em camundongos de 10 semanas de idade (Figura 3). Células e cílios são detectados em 3D, como pode ser visto na pilha z.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
Figura 1: Fluxo de trabalho experimental. Fluxograma das diferentes etapas do protocolo, desde a coleta de tecidos até a análise de imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
Figura 2: Cílios primários em tecidos murinos do camundongo ARL13B-CENTRIN-2. (A) Uma placa de crescimento de 6 semanas, com DAPI em branco, CENTRIN-2 em verde e ARL13B em vermelho, fotografada com a objetiva de 40x. (B) Amplie um cílio primário individual e seus dois centríolos. (C) Cartilagem articular e osso subcondral de um camundongo de 4 semanas de idade, fotografado com a objetiva de 20x. (D) Rim de um camundongo de 6 semanas fotografado usando a mesma tubulação do tecido musculoesquelético. (E) Ampliação da caixa branca em D mostrando cílios primários individuais e seus centríolos no rim. Barras de escala = 20 μm (A,D), 4 μm (B), 60 μm (C), 6 μm (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
Figura 3: Pipeline de detecção de células e cílios. Exemplo de aplicação do pipeline de análise de imagem em uma placa de crescimento de 10 semanas. (A) Imagem aberta no software. (B) Resultado do pipeline de detecção de células. (C) Resultado da tubulação de detecção de cílios e centríolos. Os cílios são em rosa e os centríolos em verde. A vista lateral exemplifica que a resolução é alta o suficiente para discriminar cílios orientados em diferentes direções em 3D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Reconstrução tridimensional de uma placa de crescimento de 6 semanas do camundongo ARL13B-CENTRIN-2. A reconstrução tridimensional foi realizada no software Imaris e gravada como um vídeo de animação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Figura suplementar S1: Configurações de aquisição de imagem no sistema de microscópio. (A) Janela Smart Setup para adicionar os canais e escolher o modo Airyscan . (B) Visualizador de blocos para selecionar e visualizar os blocos a serem visualizados. (C) Janela de ajuste do detector Airyscan , onde o alinhamento dos detectores Airyscan é confirmado quando todos os ladrilhos ficam verdes. (D) Configurações de laser para os três canais. (E) Modo de aquisição e configurações Z-Stack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar S2: Configurações de processamento de imagem no sistema de microscópio. (A) Configurações de processamento do Airyscan. (B) Configurações de costura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura S3 suplementar: pipelines de análise de imagem personalizados. (A) Pipeline de detecção de células usando os canais GFP e DAPI. (B) Pipeline de detecção de cílios primários e centríolos usando os canais mCherry e GFP, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

Para entender melhor o membro em crescimento, estudamos o cílio primário, uma organela que desempenha um papel fundamental na regulação da resposta das células ao seu ambiente. Para investigar o papel do cílio no crescimento, estamos imaginando-os dentro da placa de crescimento, uma camada de cartilagem onde o novo osso cresce. O cílio primário é extremamente pequeno, com menos de cinco micrômetros de comprimento, o que o torna difícil de visualizar, principalmente em três dimensões.Imaginá-lo dentro de tecidos parcialmente calcificados ricos em matriz, como cartilagem e osso, só torna ainda mais difícil explorar com precisão sua presença, sem falar na posição, orientação e tamanho. Podemos mapear a organização 3D dos cílios primários em todas as células dentro da placa de crescimento, perguntando se as células doentes montam uma onde e como ela é orientada em relação à morfogênese do tecido. Os cílios primários foram estudados anteriormente apenas em 2D em placas de crescimento ou em números muito pequenos.Os sinais fluorescentes endógenos para o cílio e centríolos trazem confiança na identificação ciliar devido ao alto sinal ao ruído e evitam a necessidade de imuno-histoquímica. Este protocolo também permite imagens coletivas de alto rendimento de centenas de cílios no tecido, permitindo-nos relacionar espacialmente os cílios com os eventos de morfogênese que estamos estudando. Esta metodologia de imagem e análise pode ser aplicada a outros tecidos para mapear os cílios primários em tecidos e órgãos.Isso permitirá uma maior compreensão da ligação entre a estrutura e a função dos cílios primários. Para começar, pegue a seção criogênica congelada preparada do tecido do camundongo e coloque a lâmina horizontalmente em temperatura ambiente para descongelar. Lave a lâmina usando uma gota de PBS por três ciclos de cinco minutos cada para remover a farsa.Aplique a solução de DAPI a 10 micromolares na lâmina e manche durante um minuto. Em seguida, monte a amostra, cubra-a com uma lamínula e deixe-a em temperatura ambiente durante a noite. Sele as bordas da lamínula usando selante de lamínula.Para configurar o microscópio confocal, ligue-o, abra o software e clique no botão Sistema. Na guia Aquisição, clique em Configuração inteligente para configurar os canais e adicionar os canais GFP, mCherry e DAPI. Em seguida, selecione a opção ARI Scan e a função sR8-Y no triângulo de varredura ARI entre resolução e velocidade.Clique em Melhor Sinal e depois em OK para confirmar. Na guia Localizar em Controle do microscópio, selecione a objetiva 40 vezes e 1,4 com imersão em óleo. Em seguida, coloque a corrediça no suporte da corrediça e levante a objetiva até que o óleo toque na lamínula.Em seguida, posicione a placa de crescimento, ou outra região de interesse, abaixo do caminho da luz. Na guia Localizar, clique em Fluorescência e selecione DAPI. E usando a ocular, mova o suporte deslizante com o joystick para posicionar a placa de crescimento, ou região de interesse, sob o campo de visão.Na guia Aquisição, selecione apenas o canal DAPI. Clique em Contínuo para view a imagem do canal DAPI na tela e certifique-se de que a placa de crescimento esteja visível. Para abrir o visualizador de blocos, clique em Mostrar Visualizador na guia Blocos.Adicione o número necessário de blocos, normalmente um bloco na direção X e três a cinco blocos na direção Y. Em seguida, clique em Visualizar e Iniciar. Agora verifique se os ladrilhos cobrem as três zonas da placa de crescimento, repouso, proliferação e hipertrófica.Ajuste a posição e o número do ladrilho, se necessário. Para configurar os parâmetros da imagem, na guia Aquisição, clique em Contínuo. Para alinhar o detector de varredura ARI, abra a janela de ajuste do detector de varredura ARI clicando no símbolo de roseta lado a lado na parte inferior.Espere até que todas as peças fiquem verdes. Na guia Canais, ajuste o ganho mestre e a potência do laser para visualizar claramente os núcleos na tela. Em seguida, selecione todos os três canais e clique em Contínuo para iniciar a geração de imagens.Permita que o detector de varredura ARI se alinhe. Na guia Modo de aquisição, defina o tamanho da imagem, o tamanho do pixel, o tamanho do quadro, a velocidade e os valores médios. Na guia Aquisição, marque a caixa de seleção Z-Stack para ativar a geração de imagens Z-stack.Em seguida, selecione apenas o canal DAPI e clique em Contínuo para visualizar a imagem na tela. Mova a objetiva para o plano mais próximo a ser fotografado. Na guia Z-Stack, clique em Definir primeiro plano, concentre-se no último plano a ser visualizado e clique em Definir último plano para configurar o intervalo de imagem.Defina o intervalo entre os planos da pilha Z para 0,15 micrômetros. Vá para o centro da faixa de imagem da pilha Z. Na guia Blocos, em Regiões de bloco, clique em Verificar e, em seguida, em Definir Z e Mover para Avançar.Agora, na guia Estratégia de foco, confirme se a estratégia de foco está definida para usar valores Z e superfície de foco definidos na configuração do bloco. Em seguida, clique em Iniciar experimento para iniciar a aquisição da imagem. Para processar as imagens, vá para a guia Processamento, selecione Modo único ou em lote, selecione Processamento de digitalização ARI, marque a opção Processamento 3D e selecione Filtro automático padrão.Escolha a imagem bruta adquirida e inicie o processamento. Depois de concluir o processamento de verificação de ARI, selecione Costura nos métodos de processamento. Escolha Nova saída, Fusível blocos, Sombreamento correto e Tudo por referência com a referência definida como DAPI.Selecione a imagem processada de digitalização ARI e inicie o processo de costura. Para começar, importe o arquivo de imagem CZI adquirido para o software e abra o painel Análise. No menu suspenso, selecione Novo pipeline.Use o botão Adicionar operação para adicionar operadores ao pipeline. Para criar um pipeline de detecção de células, importe a célula após o segmentador Python para o pipeline. Defina o nome do modelo como Cyto 2, o canal de entrada como 2, o segundo canal como 3, o diâmetro em micrômetros como 10.limite de fluxo para 0,4 e limite de probabilidade da célula para 0. Em seguida, adicione um operador de objetos de documento de importação antes do pipeline e renomeie-o para Importar rótulos manuais. Em seguida, adicione um operador de filtro de recurso de objeto após o pipeline e renomeie-o como Filtro de Tamanho.Desenhe a região de interesse usando a ferramenta Polígono no primeiro plano e no último plano. Renomeie o objeto criado e marque-o. Clique na seta azul para frente na parte superior do painel Análise para executar o pipeline.Para criar um pipeline de detecção de cílios e centríolos primários, abra o painel Análise e selecione Novo pipeline no menu suspenso. Adicione e ajuste operadores como objetos de documento de importação, dois operadores de limite, divisão, objeto, recurso, filtro e compartimento para o pipeline. Em seguida, clique na seta azul para frente na parte superior do painel Análise para executar o pipeline.Abra a janela Objetos, selecione o objeto que contém as células, cílios primários e centríolos, aqui chamados de célula do compartimento, e clique em Importar/Exportar. Selecione Exportar Excel. Escolha os recursos como número de filhos, nome, nomes dos pais, lado curto encadernado orientado em 3D, lado do meio, lado longo, ângulo XY, ângulo XZ, ângulo YZ, caixa delimitadora X1, X2, Y1, Y2, Z1, Z2, tamanho X, tamanho Y, tamanho Z, centro da geometria X, Y, Z, primeiro plano, último, contagem, malha, malha de volume e malha de área de superfície para salvar.A organização dos cílios primários foi mapeada com sucesso na placa de crescimento de um camundongo de seis semanas de idade. A imagem de alta resolução demonstrou a capacidade de visualizar centríolos individuais e cílios primários em seu ambiente tridimensional. Células e cílios primários são detectados em 3D usando o pipeline de análise de imagem, que pode diferenciar os cílios primários apontando para o lado daqueles apontando para trás.

volumetric-imaging-analysis-primary-cilia-musculoskeletal-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma técnica simples e confiável para a visualização e quantificação das vias aéreas motilidade cílios e cílios fluxo gerado usando o mouse traquéia é descrito. Esta técnica pode ser modificado para determinar como uma ampla variedade de factores que influenciam a motilidade dos cílios, incluindo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposições ambientais e / ou de factores mecânicos, tais como a carga do muco.

O método ex vivo para High Resolution Imaging de Motilidade Cilia em Rodent Airway Epithelia

Os cílios dos neurônios sensoriais olfatórios contêm proteínas da cascata de transdução de sinal, mas uma análise espacial detalhada de sua distribuição é difícil em criossecções. Descrevemos aqui uma abordagem otimizada para marcação de montagem inteira e visualização em face de proteínas ciliares.

Monte todo Rotulagem de Cilia na Olfativo Sistema de Ratos Principal

Os cílios primários influenciam várias vias de sinalização. A cóclea de mamíferos é ideal para examinar a sinalização da polaridade das células planares (PCP). A disfunção dos cílios afeta o crescimento coclear, a padronização celular e a orientação das células ciliadas, as leituras de PCP. Nosso objetivo é analisar a sinalização de PCP na cóclea de camundongo por meio de análise fenotípica, imuno-histoquímica e microscopia eletrônica de varredura.

Avaliação da Planar-Cell-Polaridade fenótipos em Ciliopathy rato mutante cóclea

Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.

Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

Cílios primários são estruturas extracelulares associadas ao centriole. A detecção primária de cílios por coloração imunofluorescente é um procedimento relativamente simples que resulta em imagens de altíssima qualidade. Neste protocolo, os fibroblastos que expressavam cílios primários foram fixados, imunossuídos e imagedos em um microscópio fluorescente ou confocal.

Detecção Simples de Cília Primária por Imunofluorescência

Este protocolo descreve a detecção da migração de células-tronco periósteis periósteis mediadas pelo CCL5 em tempo real usando microscopia intravital animal viva.

Imagem em tempo real da migração induzida por CCL5 de células-tronco esqueléticas periósteis em camundongos

O uso de inteligência artificial (IA) para analisar imagens está emergindo como uma abordagem poderosa, menos tendenciosa e rápida em comparação com métodos comumente usados. Aqui treinamos a IA para reconhecer uma organela celular, cílios primários, e analisar propriedades como comprimento e intensidade de coloração de forma rigorosa e reprodutível.

Abordagens de Inteligência Artificial para avaliar cilia primária

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Os protocolos descritos são novos métodos de visualização de estruturas periféricas na lente ocular com métodos de quantificação de imagens. Estes protocolos podem ser utilizados em estudos para melhor compreender a relação entre as estruturas da microescala do cristalino e o desenvolvimento/função do cristalino.

Imagens de montagem completa para visualizar e quantificar a estrutura da lente periférica, a morfologia e a organização da célula

Aqui, descrevemos em profundidade um método, baseado em microtomografia computadorizada, para segmentar e medir modelos 3D de ossos craniomaxilofaciais em camundongos, para melhor avaliação do desenvolvimento ósseo craniomaxilofacial em camundongos do que é possível com os métodos atuais.

Análise de malformações craniomaxilofaciais em camundongos por meio de tomografia computadorizada tridimensional

Aprenda a mapear cílios primários em 3D na placa de crescimento de camundongos transgênicos ARL13B-CENTRIN-2 usando microscopia confocal. Este método avançado permite analisar a organização e orientação dos cílios em tecidos mineralizados.

Imagem volumétrica e análise de cílios primários em tecido musculoesquelético usando o modelo de camundongo ARL13B-CENTRIN-2

Explorar mais vídeos