Células de crista neural craniana tridimensionais in vitro protocolo de diferenciação para ensaio multiplexado

Estamos interessados em entender como determinada decisão é regulada durante o desenvolvimento. Modelos organoides e tecnologias de celômica única estão nos permitindo fazer perguntas que não eram possíveis antes. O uso de modelos organoides in vitro nos permite gerar maior quantidade de dados, especialmente para populações de células transitórias, como a crista neural.

Os resultados significativos do modelo de variabilidade continuam sendo um grande desafio experimental. Demonstramos que as células da crista craniana reexpressam genes de prepotência para expandir o potencial de diferenciação. Para começar, prepare uma solução de colagenase fresca a uma concentração de dois miligramas por mililitro no meio knockout DMEM.

Aspire o meio ESC da placa do poço contendo 70 a 80% de mESC confluente. Agora, adicione delicadamente um mililitro de PBS na lateral do poço. Balance o prato para garantir uma lavagem uniforme.

Pipetar o PBS e substituí-lo por dois mililitros de solução de colagenase. Incube a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos. Verifique a placa sob um microscópio óptico com ampliação de 10X após 20 minutos de incubação e, em seguida, a cada cinco minutos.

Quando as colônias mostrarem bordas enroladas, bata vigorosamente no lado da placa para separar as colônias. Com uma pipeta serológica de cinco mililitros, recolher as colónias destacadas e transferi-las para um tubo cónico de 15 ml. Centrifugue as colônias a 16 G por três minutos em temperatura ambiente.

Aspire o máximo de meio possível do tubo cônico sem perturbar as colônias na parte inferior. Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina a 0,05% ao pellet e incuba. Com micropipetas P1000 e P200, pipetar a suspensão para cima e para baixo vigorosamente para dissociar as colônias e, em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura mESC para bloquear a tripsina.

Centrifugar o tubo a 160 G durante três minutos à temperatura ambiente. Pipetar o sobrenadante e, em seguida, adicionar um mililitro de meio de diferenciação CNCC. Conte as células com um dispositivo automatizado de contagem de células ou sob um microscópio e, em seguida, dilua as células em meio de diferenciação CNCC para atingir uma concentração de 3.000 células vivas por 50 microlitros.

Com uma micropipeta P200, semeie 50 microlitros da suspensão celular em cada poço de uma placa de 96 poços com fundo em U não tratada com TC. Complete cada poço até 200 microlitros com meio de diferenciação CNCC e incuba. Observe a placa contendo cultura de células diferenciadas de 24 horas sob um microscópio óptico para garantir que pequenos aglomerados com bordas claras sejam visíveis no fundo de cada poço.

Coloque a placa de volta na incubadora durante a noite. No segundo dia, remova lentamente 100 microlitros de meio de cada poço. Em seguida, use uma micropipeta P200 com a ponta cortada de três a quatro milímetros da extremidade para aspirar as neuroesferas junto com o meio restante.

Transfira as neuroesferas e o meio restante para uma placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC. Verificar a transferência ao microscópio óptico. Cubra cada poço com 200 microlitros de meio de diferenciação CNCC pré-aquecido.

No quarto dia, aspire 100 microlitros de meio de cada poço. Substitua-o por 100 microlitros de meio de diferenciação CNCC pré-aquecido e incube novamente. Nos dias cinco e seis, verifique a fixação das neuroesferas sob um microscópio óptico.

Certifique-se de que as células mais leves que delaminam das neuroesferas comecem a envolver seu corpo principal. Prepare o meio de manutenção CNCC de acordo com a composição fornecida. Filtrar a albumina do soro bovino através de um filtro de 0,22 micrómetros antes de a adicionar ao meio.

Depois que os fatores de crescimento forem adicionados, armazene o meio a quatro graus Celsius por até três semanas, garantindo que ele esteja protegido da luz. Adicione 100 microlitros de solução de fibronectina em cada poço de uma placa de 96 poços não tratada com TC. Enquanto a placa está em repouso, aspire o máximo possível de meio de diferenciação CNCC dos poços da placa de 96 poços de fundo plano não tratada com TC.

Substitua o meio por 50 microlitros de Accutase. Incube a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, adicione 100 microlitros de meio de manutenção CNCC em cada poço para extinguir a Accutase.

Remova a fibronectina dos poços revestidos da placa receptora. em seguida, filtre o CNCC pós-migratório destacado através de um filtro de 40 micrômetros nos poços da placa receptora. No momento desejado, use uma micropipeta P200 de ponta cortada para transferir neuroesferas da placa de 96 poços para um tubo de dois mililitros de baixa ligação de DNA.

Depois de deixar as neuroesferas se acomodarem no tubo por três minutos em temperatura ambiente, pipete o máximo de meio possível e enxágue com um mililitro de PBS frio. Para preparar as câmaras de montagem, coloque três camadas de fita transparente sem fibra de dupla face em uma lâmina de microscópio. Com uma navalha, corte uma janela de três milímetros por oito milímetros na fita dupla-face.

Sob um estereoscópio, com uma ponta de corte P200, pipete cuidadosamente as neuroesferas do agente de limpeza para a câmara de montagem. Use ampliações entre 2X e 4X para fornecer um campo de visão de toda a câmara e identificar as neuroesferas. Coloque uma lamínula na superfície da câmara e pressione levemente seus lados para aderi-la.

As culturas de neuroesferas em placas não teciduais exibiram inserções uniformes a partir do quinto dia, enquanto as culturas de placas de Petri mostraram fixação variável e fusão de neuroesferas, particularmente evidente no quarto dia. A variabilidade do tamanho das neuroesferas foi significativamente reduzida em culturas de placas de 96 poços em comparação com culturas de placas de Petri nos dias quatro e sete. O diâmetro das neuroesferas em placas de 96 poços variou de 139 micrômetros a 295 micrômetros no quarto dia e de 383 micrômetros a 552 micrômetros no sétimo dia, enquanto as culturas de placas de Petri mostraram uma faixa mais ampla.

O crescimento da neuroesfera foi exponencial em termos de número de células, aumentando de uma média de 1.082 células no segundo dia para 48.352 células no nono dia. O crescimento do diâmetro foi linear, aumentando de uma média de 136 micrômetros no segundo dia para 570 micrômetros no nono dia. A análise de imunofluorescência confirmou que as neuroesferas e células delaminantes expressam os marcadores CNCC AP2 alfa e SOX9 e EMT TWIST1 nos dias nove e 13.

PAX7 estava presente apenas nas neuroesferas.