Name: Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Aprenda a caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos humanos utilizando um chip de tetraspanina. Este método permite análise de pequenos volumes amostrais para biomarcadores não invasivos em doenças oculares.

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5 minutes

<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Incuba, lava, enxagua e seca os chips de tetraspanina. Este modelo atual não está mais disponível. Preço no momento da compra: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>Software ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Analisa as informações do chip e produz arquivos excel para análise posterior. Não está mais disponível.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Usado para escanear os chips de tetraspanina em 3 comprimentos de onda. Este modelo atual não está mais disponível. Preço no momento da compra:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>ExoView Scanner software</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Digitaliza os chips em 3 comprimentos de onda diferentes. Não está mais disponível.</td></tr><tr><td>Kits de Tetraspanina Humana</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>Inclui 8 chips de tetraspanina, Solução de Incubação, Solução de Bloqueio, anticorpo CD63, anticorpo CD81, anticorpo CD9, Solução A, Solução B, USB e tampa da placa.</td></tr></tbody></table>

caracterização de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Ao analisar as manchas nos chips, procure uma concentração ideal de EVs observando EVs marcados com fluorescência nos canais CD63, CD81 e CD9, e o canal MIgG 30,91 deve permanecer preto, pois este é o canal de controle como visto na Figura 3A. CD81 será reduzido para fluidos biológicos. Se não houver fluorescência nos canais CD63, CD81 e CD9, há ausência de EVs (Figura 3B). Tenha cuidado para não saturar demais o chip (Figura 3C). Isso tornará difícil para o software de análise calcular a precisão do tamanho, contagem total de partículas e fenótipos dos EVs. A partir dos pontos de concentração ótima, o software de análise será capaz de medir o tamanho (50-200 nm), contagem total de partículas e expressão de tetraspanina dos EVs (Figura 4) e será exportado para planilhas individuais para posterior análise. A análise da tetraspanina incluirá a colocalização das proteínas de superfície nas EVs. A colocalização será representada com um "/", por exemplo, "CD63/CD81". Isso não significa que CD63 e CD81 estejam combinados; isso significa que tanto o CD63 quanto o CD81 estão localizados na superfície do EV.
Esses resultados fornecerão informações valiosas entre amostras saudáveis e doentes. Seremos capazes de determinar se amostras saudáveis ou amostras doentes produzem mais EVs, EVs maiores ou menores e o fenótipo dos EVs. Qualquer uma ou todas essas características podem desempenhar um papel na biogênese e/ou progressão da doença. Com esses resultados, poderemos ver se há ausência ou aumento dos níveis de tetraspanina, o que pode fornecer informações sobre os processos celulares e a formação de EVs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Figura 1: Os tipos e tamanhos dos diferentes EVs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Figura 2: Esquema de como os chips de tetraspanina capturam e detectam EVs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Figura 3: Otimizando as concentrações de EV. (A) Concentração ideal de EVs. (B) Resultado negativo: nenhum EV presente. (C) Supersaturação de EVs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Figura 4: Dados gerados pelo analisador de nanopartículas. (A) Tamanho do diâmetro EV medido em nanômetros. (B) Contagem total de partículas de EVs. (C) Fenótipo co-localizado EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Técnica</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Limitações</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrífuga</td>
			<td>Alta pureza42,43</td>
			<td>Alterações na morfologia EV42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Homogeneidade42,45</td>
			<td>Requer grande volume42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Funcionalidade42,43</td>
			<td>Caro42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citometria de fluxo</td>
			<td>Avaliar amostras em vários pontos de tempo47</td>
			<td>Sinal fraco48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Vários endpoints47,50</td>
			<td>Poros entupidos51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Análise de EV único de alto rendimento52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugação de gradiente de densidade</td>
			<td>Produzir amostras altamente puras54</td>
			<td>Trabalho intensivo55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variedade de amostras55,57</td>
			<td>Demorado55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Perda significativa de rendimento54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitação</td>
			<td>Simples59,60</td>
			<td>Contaminação36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rápido61,62</td>
			<td>Não específico63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Alto rendimento44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH neutro36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtração</td>
			<td>Simples64 </td>
			<td>Armadilha de exossomos65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rápido64</td>
			<td>Danifica grandes vesículas36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Barato64</td>
			<td>Torta de filtro66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Entupimento de exossomos65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Vantagens e limitações das técnicas de isolamento de EV. Uma lista das várias maneiras de isolar os VEs, incluindo suas vantagens e limitações.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Técnica</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Limitações</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersão dinâmica de luz</td>
			<td>Meça partículas que variam em tamanho de 1 nm a 6 μM78 </td>
			<td>Não é adequado para medir amostras de exossomos complexos com grande faixa de tamanho79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>O limite inferior é de 10 nm, adequado para sistemas monodispersos79 </td>
			<td>Não é capaz de distinguir proteínas contaminadas de exossomos79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopia eletrônica de transmissão (MET)</td>
			<td>Observar a morfologia dos exossomos79,80 </td>
			<td>Preparações complicadas de amostras79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Observe a estrutura interna81 </td>
			<td>Não é capaz de distinguir exossomos com base no tamanho e na forma devido a sinais de fluorescência exagerados82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análise de rastreamento de nanopartículas</td>
			<td>Medir a concentração, o tamanho e a distribuição de tamanho dos exossomos na faixa de 10 nm a 2 μM78 </td>
			<td>Não é possível diferenciar os EVs de agregados de proteínas e outros contaminantes83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Preparação e medição rápida de amostras78,84</td>
			<td>Instrumento NTA caro85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>As amostras podem ser recuperadas na forma nativa84 </td>
			<td>Sensível a vibrações85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot (WBs)</td>
			<td>pode analisar qualitativa e quantitativamente proteínas marcadoras79,86 </td>
			<td>Complicado e demorado79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Analisando exossomos de meios de cultura de células79 </td>
			<td>Os isolados EV podem conter lipoproteínas e outros contaminantes86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citometria de fluxo</td>
			<td>Maior sensibilidade e imagem de alta resolução para</td>
			<td rowspan="2">Demorado e trabalhoso com limite de detecção de 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distinguir exossomos corados de contenções87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Baixa concentração de amostra necessária79 </td>
			<td>Sinais ópticos dificultam a precisão e a resolução88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>Meça as tetraspaninas (CD9, CD63 e CD81) nos exossomos89 </td>
			<td>Não mede tamanhos EV maiores75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mede proteínas de carga EV90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Vantagens e limitações das técnicas de caracterização de EV.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

As vesículas extracelulares servem como biomarcadores de doenças, refletindo estados fisiológicos. Nossa abordagem permite a extração de dados ricos de pequenos volumes de lágrimas, avançando na pesquisa de EV em fluidos biológicos. Os principais desafios experimentais incluem a obtenção de concentrações suficientes de vesículas extracelulares a partir de pequenas amostras, minimizando a perda de amostras durante o isolamento e otimizando a análise para evitar a supersaturação do chip ou a detecção de sinal fraco.Este protocolo ignora as etapas de isolamento, reduzindo o tempo de processamento e permite a análise de vesículas extracelulares de pequenos volumes de amostra, tornando-o ideal para amostras biológicas limitadas, como lágrimas. Os biomarcadores não invasivos são cruciais para a detecção precoce e o tratamento de distúrbios da córnea. Os biomarcadores de vesículas extracelulares permitem o monitoramento da doença, tratamentos personalizados, melhor adesão do paciente e melhor qualidade de vida.Nosso laboratório foi pioneiro na análise de vesículas extracelulares em amostras de lágrimas de indivíduos com KC, identificando assinaturas únicas de tEV. Isso abre caminho para futuros diagnósticos e alvos terapêuticos focados em EV. Para começar, coloque as amostras biológicas e um chip de tetraspanina no espaço de trabalho.Pipete 70 microlitros de amostras biológicas humanas que foram pré-misturadas com a solução B de um kit de tetraspanina humana em um chip. Coloque o filme em uma placa de lavagem de cavacos para evitar a evaporação da amostra. Após 16 horas, coloque a placa na arruela de cavacos.Trave-o no lugar e feche a tampa. Pressione a opção CW-TETRA v0 na arruela de cavacos. Enquanto os cavacos estão sendo lavados, prepare 300 microlitros de solução de bloqueio por cavaco.Adicione 0,6 microlitros de cada anticorpo por chip à solução de bloqueio. Vortex a solução de bloqueio com o coquetel de anticorpos para garantir uma mistura completa. Quando a lavagem do chip estiver concluída, adicione 250 microlitros da solução de bloqueio com o coquetel de anticorpos em cima de cada chip.Em seguida, feche a tampa e pressione Continuar. Quando o lavador de cavacos chilrear, remova a placa de lavagem de cavacos. Mova os cavacos pela rampa.Coloque a placa de volta na arruela de cavacos, garantindo que ela trave firmemente no lugar. Feche a tampa e pressione Continuar. Para começar, ligue um analisador de nanopartículas.Inicie o programa de software de digitalização na área de trabalho conectada ao analisador de nanopartículas. Selecione a pasta de cavacos para escolher cada cavaco de tetraspanina e localize-o na posição do cavaco no mandril. Clique nos três quadrados abaixo de Posição do chip para ativar a fluorescência.Os quadrados ficarão amarelos, azuis e vermelhos. Pressione a tampa do mandril e puxe-a para removê-la. Em seguida, prenda firmemente os chips de tetraspanina carregados com amostra no mandril.Alinhe os pinos da tampa do mandril com os orifícios e pressione para baixo. Deslize a tampa para travá-la no lugar. Em seguida, coloque o mandril no palco e trave-o no lugar.Em seguida, clique em Scan Chips na interface do software e, em seguida, clique em OK. Quando o stage se mover totalmente para dentro da máquina, feche a porta. Quando a verificação estiver concluída, abra a porta para ejetar o palco e verificar os resultados. Se as varreduras forem bem-sucedidas, descarte os chips.Coloque o próximo conjunto de cavacos no mandril. Em alternativa, volte a colocar o mandril vazio no palco. Saia do software e desligue a máquina quando terminar.Níveis ótimos de fluorescência de vesículas extracelulares foram observados nos canais CD63, CD81 e CD9, enquanto o canal de controle MIgG permaneceu preto, confirmando a especificidade do controle. O CD81 foi reduzido para fluidos biológicos. A ausência de fluorescência nos canais CD63, CD81 e CD9 é indicativa de ausência de vesículas extracelulares.A supersaturação da fluorescência foi evidente, dificultando o discernimento de dados significativos devido à marcação excessiva, particularmente nos canais CD63, CD81 e CD9.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Vesículas extracelulares presentes no sangue têm sido sugeridas como novos biomarcadores para várias doenças. Aqui, apresentamos um protocolo para o isolamento de grandes microvesículas derivadas da membrana plasmática de amostras de sangue periférico e sua posterior análise por citometria de fluxo convencional e Western Blotting.

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Neste protocolo, descrevemos o fluxo de trabalho completo para isolamento rápido das vesículas extracelulares de sangue total humano e caracterização de marcadores específicos pela análise de controle de nanopartículas baseada em fluorescência. Os resultados apresentados mostram um elevado nível de reprodutibilidade e podem ser ajustados para sobrenadantes de cultura de células.

Caracterização de baseada em fluorescência rápida das vesículas extracelulares única no sangue humano, com análise de acompanhamento de nanopartículas

O protocolo descreve um método reprodutível, projetado para uso com sobrenadantes de cultura celular para detectar epítopos superficiais em pequenas vesículas extracelulares (EV). Ele utiliza a imunoprecipitação de EV específica usando grânulos juntamente com anticorpos que reconhecem o antígeno de superfície CD9, CD63 e CD81. O método é otimizado para análise de citometria de fluxo a jusante.

Fluxo Cytometric análise das vesículas extracelulares de célula-condicionado Media

Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para isolar pequenas vesículas extracelulares (EVs) de tecidos, incluindo amostras de cérebro e tumor. Este método oferece uma técnica reprodutível para extrair EVs do tecido sólido para mais análises a jusante.

Extração de vesículas extracelulares de todo tecido

O presente relatório destaca os requisitos cronológicos para o isolamento da vesícula extracelular (EV) de microglia ou macrófagos sanguíneos. Os EVs derivados de microglia foram avaliados como reguladores do crescimento do neurite, enquanto os EVs derivados do macrófago sanguíneo foram estudados no controle da invasão celular C6 glioma em ensaios in vitro. O objetivo é entender melhor essas funções de EV como mediadores imunológicos em microambientes específicos.

Caracterização de vesículas extracelulares derivadas de células imunes e estudo do impacto funcional no ambiente celular

O protocolo aqui demonstra que as vesículas extracelulares podem ser adequadamente separadas de meios de cultura celular condicionados usando cromatografia de exclusão de tamanho.

Cromatografia de Exclusão de Tamanho para Separação de Vesículas Extracelulares de Meios de Cultura Celular Condicionada

O presente protocolo descreve um método para extração de vesículas extracelulares do sangue periférico e tecidos sólidos com posterior perfilamento de antígenos de superfície e cargas proteicas.

Isolamento e Análise de Vesículas Extracelulares Rastreáveis e Funcionalizadas do Plasma e Tecidos Sólidos

A última geração de ferramentas de caracterização de EV é capaz de uma única análise de EV em vários parâmetros simultaneamente. A citometria de nanofluxo mede todas as partículas biológicas maiores que 45 nm sem marcação e identifica características específicas de subpopulações por uma variedade de técnicas de marcação fluorescente.

Caracterização da Proteína Transmembrana da Vesícula Extracelular Única por Citometria de Nanofluxo

Este artigo descreve uma metodologia para o isolamento, caracterização e quantificação de vesículas extracelulares derivadas de plasma humano (EV) e apresenta um fluxo de trabalho para análise sem marcação do proteoma EV usando cromatografia líquida-espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caracterização e análise proteômica de vesículas extracelulares derivadas de plasma para descoberta de biomarcadores cardiovasculares

Este protocolo fornece uma descrição detalhada da classificação de vesículas extracelulares (EVs) liberadas por células estromais mesenquimais. Em particular, ele se concentra na configuração do instrumento e na otimização das condições de classificação. O objetivo é classificar as vesículas extracelulares, preservando suas características.

Configurando uma classificação bem-sucedida para isolamento de vesículas extracelulares

Aprenda a caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos humanos utilizando um chip de tetraspanina. Este método permite análise de pequenos volumes amostrais para biomarcadores não invasivos em doenças oculares.

Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos

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