Caracterização de Vesículas Extracelulares a partir de Fluidos Biológicos
28 de fevereiro de 2025
Aqui, demonstramos o método de caracterização de vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos, como lágrimas e saliva, de seres humanos. O scanner usado neste método é capaz de detectar o fenótipo, tamanho e contagem total de partículas de EVs a partir de 1 μL da amostra.
As vesículas extracelulares servem como biomarcadores de doenças, refletindo estados fisiológicos. Nossa abordagem permite a extração de dados ricos de pequenos volumes de lágrimas, avançando na pesquisa de EV em fluidos biológicos. Os principais desafios experimentais incluem a obtenção de concentrações suficientes de vesículas extracelulares a partir de pequenas amostras, minimizando a perda de amostras durante o isolamento e otimizando a análise para evitar a supersaturação do chip ou a detecção de sinal fraco.
Este protocolo ignora as etapas de isolamento, reduzindo o tempo de processamento e permite a análise de vesículas extracelulares de pequenos volumes de amostra, tornando-o ideal para amostras biológicas limitadas, como lágrimas. Os biomarcadores não invasivos são cruciais para a detecção precoce e o tratamento de distúrbios da córnea. Os biomarcadores de vesículas extracelulares permitem o monitoramento da doença, tratamentos personalizados, melhor adesão do paciente e melhor qualidade de vida.
Nosso laboratório foi pioneiro na análise de vesículas extracelulares em amostras de lágrimas de indivíduos com KC, identificando assinaturas únicas de tEV. Isso abre caminho para futuros diagnósticos e alvos terapêuticos focados em EV. Para começar, coloque as amostras biológicas e um chip de tetraspanina no espaço de trabalho.
Pipete 70 microlitros de amostras biológicas humanas que foram pré-misturadas com a solução B de um kit de tetraspanina humana em um chip. Coloque o filme em uma placa de lavagem de cavacos para evitar a evaporação da amostra. Após 16 horas, coloque a placa na arruela de cavacos.
Trave-o no lugar e feche a tampa. Pressione a opção CW-TETRA v0 na arruela de cavacos. Enquanto os cavacos estão sendo lavados, prepare 300 microlitros de solução de bloqueio por cavaco.
Adicione 0,6 microlitros de cada anticorpo por chip à solução de bloqueio. Vortex a solução de bloqueio com o coquetel de anticorpos para garantir uma mistura completa. Quando a lavagem do chip estiver concluída, adicione 250 microlitros da solução de bloqueio com o coquetel de anticorpos em cima de cada chip.
Em seguida, feche a tampa e pressione Continuar. Quando o lavador de cavacos chilrear, remova a placa de lavagem de cavacos. Mova os cavacos pela rampa.
Coloque a placa de volta na arruela de cavacos, garantindo que ela trave firmemente no lugar. Feche a tampa e pressione Continuar. Para começar, ligue um analisador de nanopartículas.
Inicie o programa de software de digitalização na área de trabalho conectada ao analisador de nanopartículas. Selecione a pasta de cavacos para escolher cada cavaco de tetraspanina e localize-o na posição do cavaco no mandril. Clique nos três quadrados abaixo de Posição do chip para ativar a fluorescência.
Os quadrados ficarão amarelos, azuis e vermelhos. Pressione a tampa do mandril e puxe-a para removê-la. Em seguida, prenda firmemente os chips de tetraspanina carregados com amostra no mandril.
Alinhe os pinos da tampa do mandril com os orifícios e pressione para baixo. Deslize a tampa para travá-la no lugar. Em seguida, coloque o mandril no palco e trave-o no lugar.
Em seguida, clique em Scan Chips na interface do software e, em seguida, clique em OK. Quando o stage se mover totalmente para dentro da máquina, feche a porta. Quando a verificação estiver concluída, abra a porta para ejetar o palco e verificar os resultados. Se as varreduras forem bem-sucedidas, descarte os chips.
Coloque o próximo conjunto de cavacos no mandril. Em alternativa, volte a colocar o mandril vazio no palco. Saia do software e desligue a máquina quando terminar.
Níveis ótimos de fluorescência de vesículas extracelulares foram observados nos canais CD63, CD81 e CD9, enquanto o canal de controle MIgG permaneceu preto, confirmando a especificidade do controle. O CD81 foi reduzido para fluidos biológicos. A ausência de fluorescência nos canais CD63, CD81 e CD9 é indicativa de ausência de vesículas extracelulares.
A supersaturação da fluorescência foi evidente, dificultando o discernimento de dados significativos devido à marcação excessiva, particularmente nos canais CD63, CD81 e CD9.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método inovador para caracterizar vesículas extracelulares (EVs) coletadas de fluidos biológicos humanos, como lágrimas e saliva. Ao utilizar um chip de tetraspanina, a abordagem facilita a análise de EVs a partir de volumes mínimos de amostra, avançando o estudo de biomarcadores não invasivos para monitoramento de doenças.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Vesículas extracelulares
- Biomarcadores não invasivos
- Doenças oculares
Contexto
- EVs servem como indicadores de estados fisiológicos e doenças
- Desafios incluem baixas concentrações em pequenas amostras e tempo de processamento da amostra
- Importância da detecção precoce de distúrbios corneanos
Métodos Utilizados
- Uso de um chip de tetraspanina para análise de EV
- Amostras biológicas humanas (lágrimas)
- Detecção baseada em fluorescência de marcadores de EV CD63, CD81 e CD9
Principais Resultados
- Integração de etapas de preparação e análise de amostra reduz o tempo de processamento
- Níveis de fluorescência dos marcadores de EV confirmaram especificidade e presença
- Identificação de assinaturas de tEV em amostras de lágrimas de indivíduos com ceratocone
Conclusões
- Este método fornece uma abordagem simplificada para a análise de EV a partir de pequenas amostras biológicas
- Os resultados apoiam diagnósticos futuros e alvos terapêuticos na saúde ocular
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
