Visualizando a dinâmica microbiana do ciclo de metano em zonas úmidas costeiras

Este estudo combinou visualmente a distribuição espacial e temporal dos principais genes microbianos do ciclo de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas, ele explora como os fatores ambientais regulam a dinâmica do metano. Nossas descobertas revelam que a abundância de genes de ciclagem de metano nas zonas úmidas costeiras do sul do Texas é sensível às condições ambientais, incluindo salinidade e estação. Em particular o mmoX, um tipo de gene da monooxigenase do metano, é mais abundante nas estações mais frias.

Este protocolo aborda a pesquisa na detecção de genes microbianos que ciclam metano, oferecendo novas ferramentas para visualizar a dinâmica microbiana espacial e sazonal influenciada por fatores ambientais. Ao integrar métodos de PCR otimizados com visualização GIS, este protocolo fornece detecção aprimorada e mapeamento espacial de genes de ciclagem de metano enquanto captura padrões microbianos dinâmicos, espaciais e sazonais influenciados por fatores ambientais.

[Narrador] Para começar, prepare uma mistura de reação de cPCR de 25 microlitros com o eDNA e outros componentes. Coloque os tubos na máquina de PCR e execute a reação de cPCR com os parâmetros apropriados. Após a cPCR, prepare a mistura de reação qPCR contendo verde cibernético, excluindo o DNA molde. Dispense 57 microlitros da mistura de reação preparada em cada tubo de PCR. Adicione 3 microlitros de DNA modelo, água padrão ou livre de nuclease a cada tubo e bata suavemente no tubo para misturar. Alíquota de 20 microlitros da mistura de reação preparada de cada tubo em poços designados de uma placa qPCR de 96 poços. Sele a placa PCR com um filme adesivo de vedação PCR usando um aplicador. E centrifugue-o a 1.000 x g por um minuto para garantir a mistura adequada e eliminar quaisquer bolhas dentro dos poços. Coloque a placa PCR no termociclador. Ligue a máquina qPCR e abra o software relacionado para configurar o protocolo. Configure o programa qPCR e inicie a execução. Abra o software do sistema de informações geográficas, ArcGIS Pro, e salve o arquivo de projeto com o nome Área de Estudo na pasta especificada no computador. Clique em Mapa, selecione Mapa Base e escolha terreno com rótulos como mapa base. Clique em Localizar e, em seguida, clique em Pesquisar. Quando a barra de pesquisa abrir, digite o nome da área de estudo para localizá-la no mapa. Para desenhar a área específica usando georreferenciamento, clique em Exibir e, em seguida, em Painel de catálogo na camada superior. Clique duas vezes na pasta do catálogo e selecione o nome do arquivo necessário. Clique com o botão direito do mouse no arquivo .gdb do banco de dados geográfico. Clique em Novo e selecione Classe de Feição. Em seguida, a janela Criar classe de feição aparecerá. Digite a caixa Nome e alias e clique em Concluir na parte inferior. Agora, clique em Exibir, seguido de Conteúdo. O nome do alias aparecerá no painel Conteúdo. Clique em Editar na camada superior, seguido de Criar. O painel Criar Feições será aberto. Clique duas vezes no alias no painel Criar Recursos e as opções Configurar Feedback da Ferramenta serão exibidas. Selecione linhas e, em seguida, desenhe linhas no mapa para criar o limite da área de estudo. Clique duas vezes no mapa para concluir. Minimize o software GIS e abra uma planilha. Digite o nome da amostra na primeira coluna, a latitude na segunda coluna e a longitude na terceira coluna. Use as próximas quatro colunas para dados qPCR de pmoA1, pmoA2, mmoX e mcrA. Salve o arquivo no formato CSV em uma pasta específica no computador. Em seguida, abra o software GIS e clique em Adicionar dados, seguido de Dados de ponto XY. Selecione o arquivo CSV salvo na pasta na caixa Tabela de Entrada. Renomeie o arquivo na caixa Classe de Feição de Saída e clique em Executar para exibir os pontos de amostragem no mapa. Agora, clique na barra de pesquisa na parte superior e pesquise Krigagem. Selecione o arquivo da estação de amostragem e escolha pmoA1. Em seguida, clique no ambiente, selecione a estação de amostragem em camada e máscara e clique em Executar. Para criar um layout do mapa, clique em Inserir, Novo Layout e selecione ANSI-Landscape. Clique em Map Frame, selecione o mapa com krigagem e coloque todos os mapas no layout desenhando retângulos. Selecione Seta Norte e coloque-a no layout para indicar a direção norte. Em seguida, selecione Barra de escala para exibir a escala da área no mapa. Clique em Legenda e coloque-a no layout para exibir as legendas do mapa. Clique em Grade e selecione qualquer opção de retícula preta para criar uma grade com latitude e longitude. A grade aparecerá no painel Conteúdo com o rótulo Retícula de rótulo horizontal preto. Clique duas vezes na retícula de etiqueta horizontal preta, selecione Componentes e remova os tiques 1 e a grade clicando no sinal de cruz à direita. Por fim, clique em Compartilhar na camada superior e clique em Exportar layout. Selecione o tipo de arquivo como PDF, salve o arquivo no computador utilizando a caixa Nome, defina a resolução vertical para 500 DPI e clique em Exportar para criar o arquivo PDF do mapa. A análise de cPCR revelou variabilidade espacial na detecção de genes relacionados ao ciclo de metano, com genes mcrA detectados em todas as amostras de LB e RV, mas ausentes nas amostras de BC, ligando a salinidade à distribuição de metanogênio. A cPCR mostrou bandas mais brilhantes para pmoA1 com pares de primers A189-mb661, confirmando abundância baixa, mas detectável em amostras de RV, enquanto estava ausente em LB e BC. A análise de qPCR mostrou alta variação sazonal, com os genes mmoX mais abundantes durante a estação fria e o pmoA1 mais abundante durante a estação quente.