Name: Detecção de Bolhas Nucleares e Vazamento de DNA em Células de Mamíferos por Imunofluorescência (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprenda a detectar bolhas nucleares e vazamento de DNA em células HeLa por imunofluorescência. Este método revela alterações estruturais em laminopatias como a síndrome de progeria.

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<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
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<li>Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+prelamin+A+biogenesis+reveals+the+nucleus+to+be+a+CaaX+processing+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment.</a> Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).</li>
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<li>Eriksson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+de+novo+point+mutations+in+lamin+A+cause+Hutchinson%E2%80%93Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome.</a> Nature. 423, 293-298 (2003).</li>
<li>Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+review+series%3A+Lipid+post-translational+modifications.+Prelamin+A%2C+Zmpste24%2C+misshapen+cell+nuclei%2C+and+progeria%E2%80%94new+evidence+suggesting+that+protein+farnesylation+could+be+important+for+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis.</a> J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).</li>
<li>Worman, H. J., Michaelis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelamin+A+and+ZMPSTE24+in+premature+and+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging.</a> Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).</li>
<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
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<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
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A lâmina nuclear é uma rede de filamentos que sustenta a membrana nuclear e é composta de proteínas chamadas laminas. A lâmina nuclear desempenha papéis essenciais na arquitetura nuclear, posicionamento dos poros nucleares, regulação da expressão gênica, organização da cromatina, replicação do DNA e reparo do DNA 1,2,3. Mutações em genes que desempenham um papel na expressão das proteínas laminadas levam a distúrbios genéticos chamados laminopatias3.
A dermopatia restritiva (DR) é um distúrbio grave da laminopatia predominantemente causado por mutações heterozigóticas compostas que criam códons de terminação prematura no geneZMPSTE24 4, levando à ausência da metaloprotease ZMPSTE24. Essa laminopatia é caracterizada por retardo de crescimento intrauterino, pele rígida e firme, boca pequena, cabelos finos e defeitos de mineralização óssea1. Os pacientes com DR geralmente não vivem além da primeira semana de vida devido à insuficiência pulmonar1. Dois outros distúrbios de laminopatia conhecidos como síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford atípica (AT-HGPS) e displasia mandibuloacral tipo B (MAD-B) envolvem expressão ZMPSTE24 reduzida e estão associados à redução da expectativa de vida e mostram semelhanças com distúrbios de envelhecimento prematuro5. A protease ZMPSTE24 que é impactada nessas laminopatias é vital na modificação pós-tradução da lamina A, que é um componente crítico da lâmina nuclear. ZMPSTE24 deficiência resulta no acúmulo de uma forma farnesilada incompletamente processada de lamina A, conhecida como prelamina A2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Figura 1: Processamento de lamina A em normal vs. Células RD. Via de processamento da lamina A em células normais (esquerda) e processamento alterado da lâmina A em RD ou células deficientes em ZMPSTE (direita). Os grupos farnesil (Fa) e metil (Me) são indicados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Como visto na Figura 1, no processamento normal da lamina A, um grupo farnesil (lipídio) é ligado a um resíduo de cisteína próximo ao terminal C, seguido por clivagem proteolítica de três aminoácidos C-terminais 3,6. O resíduo de cisteína é então metilado. Essas duas modificações permitem que a prelamina A seja direcionada para a membrana nuclear interna2. ZMPSTE24 então realiza uma reação de clivagem pela qual os últimos 15 aminoácidos C-terminais, juntamente com os grupos farnesil e metil, são removidos para produzir a proteína Lamina A madura, que é entregue à lâmina nuclear 6,7,8. Em RD, AT-HGPS e MAD-B, a etapa final do processamento não ocorre de forma eficaz, uma vez que a metaloproteinase ZMPSTE24 está ausente ou não está totalmente funcional 8,9. Isso resulta no acúmulo de prelamina A, que permanece permanentemente farnesilada e metilada9. Esses últimos grupos fazem com que a prelamina A grude na membrana nuclear interna em vez de se localizar na lâmina nuclear, onde a lâmina A madura deve residir, como visto na Figura 1. Assim, a deficiência de ZMPSTE tem efeitos profundos em uma variedade de funções nucleares, juntamente com a estrutura nuclear10,11,12,13,14,15. Essas alterações na estrutura nuclear podem incluir bolhas nucleares e até rupturas nucleares, que podem resultar no vazamento de DNA para o citosol, bem como na entrada de citosol no núcleo. Núcleos de formato aberrante são de fato uma marca registrada de distúrbios de lamaminopatia, juntamente com vários outros fenótipos que são causados pelo processamento defeituoso da prelamina A16,17. Defeitos na lâmina nuclear levam a uma infinidade de impactos prejudiciais, incluindo a localização incorreta do controle de qualidade da proteína nuclear e proteínas de reparo de DNA no nucleoplasma, o que, por sua vez, resulta em vários defeitos na função nuclear18. É importante ter uma técnica simples que possa ajudar a identificar e monitorar essas características das laminopatias para facilitar a pesquisa sobre o desenvolvimento de abordagens terapêuticas destinadas a melhorar os fenótipos da laminopatia. Para camundongos com laminopatias, foi demonstrado que a eliminação da bolha nuclear se correlaciona com a eliminação generalizada dos fenótipos de laminopatia16. Uma técnica que permite o monitoramento da integridade nuclear em células humanas pode aprimorar o estudo de possíveis tratamentos para eliminar ou melhorar significativamente os fenótipos da doença.
A imunofluorescência indireta (FI) é uma técnica sensível e amplamente utilizada que utiliza tanto um anticorpo primário não marcado quanto um anticorpo secundário marcado com fluoróforo que reconhece o anticorpo primário para detectar um alvo de interesse19. Os métodos de jejum intermitente podem fornecer um meio poderoso para visualizar componentes e estruturas intracelulares específicos. Também é possível que mais de uma molécula de anticorpo secundário possa interagir com o anticorpo primário, resultando na amplificação do sinal19. O FI indireto é uma técnica versátil que também permite a detecção de múltiplos anticorpos primários com um conjunto relativamente pequeno de anticorpos secundários, uma vez que os anticorpos secundários são elevados contra o domínio Fc do anticorpo primário, que é conservado dentro da espécie19.
Este artigo descreve um método indireto (IF) para avaliar o sangramento nuclear e o vazamento de DNA em células deficientes em ZMPSTE24, usando anticorpos contra DNA de fita dupla (dsDNA) e lamina B1 para detectar DNA e lâmina nuclear, respectivamente. Para demonstrar a utilidade dessa abordagem, o procedimento foi aplicado a uma linhagem celular HeLa com expressão de ZMPSTE24 nocauteada, bem como a uma linhagem celular HeLa que expressa ZMPSTE24, e os resultados para as duas linhagens celulares foram comparados.

<table><tbody><tr><td>Lamínulas de Vidro Quadradas de 22 mm</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>Qualquer tamanho ou forma pode ser usada, desde que possam ser fixadas a uma lâmina de microscópio padrão.&nbsp;</td></tr><tr><td>36,5% de Formaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Reagente de Fixação.&nbsp;</td></tr><tr><td>75 cm 2 Frascos</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Para cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>Soro Bovino Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Tampão de diluição de anticorpo.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM com 1 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Para cultura de células.</td></tr><tr><td>Etanol (200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Para desidratação de amostras antes da montagem, diluído para fazer múltiplas concentrações.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscópio de Fluorescência Digital Invertido EVOS FL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Imaging.&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelatina de Peixe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Tampão de diluição de anticorpo.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Meio de montagem para prevenir fotobranqueamento.&nbsp;</td></tr><tr><td>Parafilme (4 pol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Qualquer tamanho pode ser substituído, desde que as lamínulas usadas possam caber.&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Para cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>N / A</td><td>N / A</td><td>Feito e esterilizado em laboratório para cultura de tecidos e soluções.</td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino Premium (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Para cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>Lâminas de Microscópio Premium Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>Qualquer lâmina de microscópio padrão pode ser usada.&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Fundo Plano de 6 poços Tratadas para Cultura de Tecidos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Para cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Para lavar.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Para cultura de células.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Reagente de permeação celular.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

detecção de bolhas nucleares e vazamento de dna em células de mamíferos por imunofluorescência

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Este estudo apresenta um método IF para visualizar a lâmina nuclear em conjunto com DNA de fita dupla (dsDNA). Uma vez que o IF é realizado, as imagens capturadas podem ser examinadas em busca de sinais de bolhas nucleares e vazamento de DNA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Figura 2: Bolhas nucleares em células HeLa CT e <stro...

Detecção de Bolhas Nucleares e Vazamento de DNA em Células de Mamíferos por Imunofluorescência

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um método de se observar as moléculas individuais de DNA em células vivas é descrito. A técnica baseia-se na ligação de uma proteína fluorescente etiquetado repressor lac para os locais de ligação para a engenharia de ADN de interesse. Este método pode ser adaptado para seguir muitas DNAs recombinantes em células vivas ao longo do tempo.

Monitorando a replicação plasmídeo em células vivas de mamíferos longo de múltiplas gerações por microscopia de fluorescência

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Visualização baseada em imunofluorescência das interações da proteína de reparo do DNA

Neste vídeo, descrevemos a técnica de microscopia de imunofluorescência para detectar proteínas específicas de resposta a danos no DNA localizadas nos locais de quebras de fita dupla de DNA em células mononucleares humanas. As proteínas são reconhecidas por anticorpos primários específicos, que por sua vez se ligam a anticorpos secundários marcados com fluoróforo que fluorescem durante a visualização microscópica, permitindo a visualização das proteínas como focos fluorescentes distintos dentro...

Microscopia de imunofluorescência para análise de quebras de fita dupla de DNA

Este manuscrito descreve uma nova técnica que permite a detecção da expressão gênica intracelular após a endocitose de nanopartículas marcadas com fluorescência diretamente em células vivas. O método não requer manipulação das células e não é restrito em relação ao gene ou espécie alvo.

Detecção de intracelular Expressão Gênica em células vivas de murino, humano e porcino Origem Usando nanopartículas marcados com fluorescência

Aqui, é demonstrado como o Ensaio de Ligação à Proximidade in situ (PLA) pode ser usado para detectar e visualizar as interações proteínas-proteínas diretas entre ATM e p53 em culturas de células suspensas expostas ao estresse genotóxico.

Detecção e visualização de complexos de proteína induzidos por dano do DNA em culturas de células de suspensão usando o Ensaio de Ligação de Proximidade

Microirradiation do laser é uma ferramenta útil para estudos de reparo de ADN em células vivas. Uma abordagem metodológica para o uso de lasers UVA para induzir várias lesões do ADN é mostrada. Otimizamos a um método para microirradiation local que mantém o ciclo celular normal; assim, as células irradiadas prosseguir através de mitose.

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Fluorescência confocal laser e microscopia microirradiação oferta ferramentas para indução de dano do ADN e monitoramento da resposta das proteínas de reparo de DNA em áreas selecionadas do sub nucleares. Esta técnica tem significativamente nosso conhecimento avançado de detecção de danos, sinalização e recrutamento. Este manuscrito demonstra essas tecnologias para examinar reparação simples e dupla vertente.

Aplicação de Laser Microirradiação para exame de Single e Double Strand reparação em células de mamíferos

Imagem latente da viver-pilha fornece uma riqueza de informações sobre células únicas ou populações inteiras que é inatingível por célula fixa imagem sozinho. Aqui, viver-pilha protocolos de imagens para avaliar as decisões de destino célula após o tratamento com a droga antimitótica paclitaxel são descritos.

A longo prazo viver-pilha de imagem para avaliar o destino da célula em resposta ao Paclitaxel

Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.

Caracterizando os processos de reparação do DNA no transitório e duradouro dobro-Costa quebras de DNA pela microscopia de imunofluorescência

A resposta de dano de DNA induzida por radiação ativada pelo feixe misto de nêutrons usado na terapia de captura de nêutrons de boro (BNCT) não foi totalmente estabelecida. Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para detectar focos induzidos por radiação (RIF) de proteínas de reparação por manchas de imunofluorescência em linhas de células cancerígenas de cólon humano após a irradiação com o feixe misturado de nêutrons.

Imagens de imunofluorescência de dna dano e reparo de focos em células cancerígenas de cólon humano

No presente protocolo, demonstramos como visualizar a ressecção final de dupla vertente de DNA durante a fase S/G2 do ciclo celular usando um método baseado em imunofluorescência.

Avaliação da ressecção final de duplo fio de DNA global usando rotulagem brdu-DNA juntamente com a discriminação do ciclo celular

Aprenda a detectar bolhas nucleares e vazamento de DNA em células HeLa por imunofluorescência. Este método revela alterações estruturais em laminopatias como a síndrome de progeria.

Detecção de Bolhas Nucleares e Vazamento de DNA em Células de Mamíferos por Imunofluorescência

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