Sinais de imagem de Ca²⁺ em pequenas veias pulmonares a pressões intraluminais fisiológicas

Neste protocolo, apresentamos uma nova técnica para registrar e analisar sinais de Ca²⁺ em veias intrapulmonares (pequenas veias pulmonares ou VPs) em pressões intraluminais fisiológicas. A técnica envolve isolar pequenas PVs, incubá-las com um indicador de Ca²⁺ , canulá-las e pressurizá-las, imagens confocais de sinais de Ca²⁺ e análise de dados.

Os sinais de cálcio regulam a função dos vasos sanguíneos, variando em fonte e função. Nosso objetivo é entender suas funções específicas na parede vascular e identificar anormalidades ligadas à doença. A maioria dos estudos de vasos sanguíneos pulmonares se concentra em artérias ou capilares, não em veias pulmonares.

Nenhum estudo examinou os sinais de cálcio nas veias pulmonares sob pressões intraluminais normais, apesar de sua relevância fisiológica. As veias pulmonares sofrem mudança de pressão durante os ciclos cardiovasculares, mas seu impacto nos sinais de cálcio não foi estudado. Nosso protocolo permite a aquisição e análise automática de sinais de cálcio em pequenas veias pulmonares à pressão normal.

Nosso protocolo permite estudos futuros sobre como a pressão intraluminal afeta os sinais de cálcio em pequenas veias pulmonares, avançando na compreensão de sua regulação e papel na saúde e na doença. Para começar, limpe as ferramentas de dissecação e a louça em etanol 100% e, em seguida, lave-as em água deionizada. Com uma tesoura.

Abra a cavidade torácica de um camundongo sacrificado. Use uma pinça para remover cuidadosamente o coração e os pulmões da cavidade torácica com o mínimo de toque nos pulmões. Em seguida, coloque o tecido em uma placa revestida com proteção de vedação contendo solução salina fisiológica tamponada com HEPES frio.

Prenda o coração e os pulmões usando pinos de dissecação para que as grandes veias pulmonares e artérias pulmonares fiquem claramente visíveis e o lobo esquerdo do pulmão fique ligeiramente esticado. Usando as grandes veias pulmonares como pontos de referência, remova cuidadosamente o tecido ao redor das pequenas veias interpulmonares com a ajuda de uma tesoura fina. Em seguida, isole suavemente as pequenas veias pulmonares do tecido circundante.

Em seguida, prepare uma concentração de estoque de 2,5 milimolares Fluo-4 AM com DMSO. Usando a solução de estoque, prepare a solução de carregamento. Coloque as pequenas veias pulmonares em um tubo de 1,5 mililitro com a solução de carga.

Cubra o tubo com papel alumínio, incubado em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora. Para canular as pequenas veias pulmonares, remova uma veia da solução de lavagem. Coloque-o em uma câmara de miografia de pressão preparada.

Com um par de pinças de ponta fina, canule cuidadosamente uma extremidade da pequena veia pulmonar em uma das cânulas e, em seguida, use um microfilamento de fio de náilon para dar um nó ao redor da extremidade canulada da pequena veia pulmonar e da ponta da cânula para prendê-la. Empurre a solução salina fisiológica suavemente através da cânula para remover o sangue dentro da veia pulmonar. Use fio de náilon para amarrar a outra extremidade com uma cânula de vidro usando microfilamentos.

Para imagens de cálcio, primeiro conecte um controlador de pressão servo a uma tubulação contendo solução salina fisiológica tamponada com HEPES. Use o controlador para pressurizar a pequena veia pulmonar de uma extremidade. Agora conecte uma bomba peristáltica a uma entrada e uma saída e uma saída e superfunda a solução.

Após o período de equilíbrio, use a objetiva de imersão em água de 40x e um sistema de imagem confocal de disco giratório para adquirir imagens de cálcio para 1.000 quadros. Para realizar a análise de imagem, inicie o Spark e o software personalizados. Use o filtro cinco por cinco e o filtro mediano para suavizar as imagens, seguido por um quadro delineando uma região plana da veia pulmonar com várias células para detecção automática de eventos.

Clique em exibir e Detecção automática de eventos. Defina o limite de eventos em uma amplitude de 1,3F sobre F0, a tolerância para 20%, a caixa de digitalização para sete por sete pixels e a média de execução para sete imagens. Clique em Iniciar pesquisa ou no ícone de olho.

Encontre a tabela de eventos clicando na tabela de pequenos eventos no menu de visualização e, em seguida, calcule os eventos por micrômetro quadrado dividindo o número de sinais de íons de cálcio detectados pela área do quadro selecionado. O número de sinais de cálcio que ocorrem espontaneamente em pequenas veias pulmonares a cinco milímetros de pressão intraluminal de mercúrio foi de 0,73 mais ou menos 0,2 eventos por minuto por micrômetro quadrado em condições basais. A adição de rianodina reduziu drasticamente a atividade de sinalização do cálcio.