Metodologia aprimorada para estudar a osteogênese pós-natal via ossificação intramembranosa em um modelo de lesão da medula óssea murina

Nossa pesquisa está focada na compreensão dos mecanismos de reparo ósseo usando o modelo de lesão da medula óssea. Nosso objetivo é descobrir como a ossificação intramembranosa é regulada durante a cicatrização e explorar abordagens terapêuticas que podem ser aproveitadas para melhorar a regeneração óssea. Estudos recentes no campo estabeleceram marcadores de superfície que definem células-tronco esqueléticas e progenitoras, revelando seus papéis críticos no desenvolvimento e reparo ósseo.

Nosso protocolo permite investigar as contribuições dessas células durante a ossificação intramembranosa, o que nos permite explorar sua regulação e potencial de direcionamento terapêutico durante o reparo ósseo. Nosso protocolo aborda a lacuna na compreensão do reparo ósseo apenas por meio da ossificação intramembranosa no contexto pós-natal, usando um modelo clinicamente relevante. Em contraste com outros modelos de lesão usados para estudar a ossificação intramembranosa, nosso protocolo fornece um ambiente mais controlado e respostas de lesão reprodutíveis, especificamente nos ossos longos.

No futuro, nosso laboratório utilizará o modelo de lesão da medula óssea juntamente com abordagens farmacológicas localizadas para modular transitoriamente os reguladores epigenéticos da osteogênese. Nosso objetivo é melhorar a regeneração e a cicatrização óssea por meio de novas abordagens terapêuticas. Para começar, prepare e desinfete todas as superfícies de trabalho com um limpador desinfetante de nível clínico.

Cubra a plataforma de aquecimento com uma almofada cirúrgica estéril. Reúna e organize todos os instrumentos estéreis, bem como os reagentes. Agora, pese o mouse usando uma balança de precisão.

Com base na formulação disponível de buprenorfina, calcule o volume necessário para administração de analgésicos. Depois de anestesiar o mouse, remova-o cuidadosamente da câmara de indução. Coloque o animal na almofada cirúrgica estéril em decúbito dorsal e encaixe o cone do nariz sobre a cabeça do camundongo.

Remova brevemente o camundongo do cone nasal e injete a dose calculada de analgésico buprenorfina de liberação prolongada por via subcutânea. Em seguida, coloque cuidadosamente o mouse de volta na unidade de anestesia do cone nasal. Encha uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 26 com solução salina estéril e coloque-a de lado.

Remova o pelo do membro posterior onde o procedimento será realizado usando tesouras elétricas ou operadas por bateria. Usando aplicadores estéreis com ponta de algodão, aplique um esfoliante com iodopovidona a 10% no local da cirurgia, seguido da aplicação de esfoliante com álcool isopropílico a 70% e deixe a área secar completamente. Agora coloque o mouse de costas e flexione o joelho da perna operada.

Segure a perna com a mão não dominante de forma que o joelho fique dobrado sobre o dedo médio. O segundo dedo repousa sobre o fêmur e o polegar repousa sobre a tíbia. Usando um bisturi, faça uma incisão horizontal pequena e rasa logo abaixo da patela.

Localize o espaço articular com a agulha colocada horizontalmente sobre o joelho dobrado e sinta o espaço entre o fêmur e a tíbia. Use este guia anatômico para perfurar manualmente o fêmur distal do joelho em direção ao lado proximal com uma agulha de calibre 25. Insira a agulha através ou ao redor da patela.

Confirme a colocação adequada da agulha na cavidade medular com um raio-x, garantindo que esteja o mais próximo possível do centro. Depois de remover a agulha de calibre 25, insira imediatamente uma agulha de calibre 26 no mesmo orifício dentro da cavidade da medula. Alargar as laterais da cavidade medular em movimentos circulares pelo menos cinco vezes até ficar lisa.

Em seguida, remova a agulha de calibre 26 e lave a cavidade com 1,5 a 2 mililitros de solução salina até que o refluxo fique limpo. Descarte com segurança a seringa e a agulha em um recipiente designado. Em seguida, feche a ferida na pele usando uma sutura adesiva tópica.

Imediatamente após a cirurgia, administre a dose restante de buprenorfina de liberação prolongada, conforme calculado anteriormente. Monitore o animal na almofada de aquecimento em busca de sinais de respiração normal e desobstruída.