In vitro Teste de trombose para dispositivos de assistência ventricular

Nosso objetivo é desenvolver um protocolo de bancada prático e acessível para identificar possíveis pontos de acesso trombogênicos em dispositivos de assistência ventricular, preenchendo a lacuna crítica entre a prototipagem precoce e os testes em animais. Os testes em animais persistiram como o principal método para avaliar a trombose em dispositivos de assistência ventricular. Embora a dinâmica de fluidos computacional tenha se tornado uma ferramenta inestimável para verificação de projetos, ela ainda não pode suplantar a validação in vitro e in vivo.

A natureza complexa da presença de coagulação sanguínea e vários fatores de confusão, dificultando a distinção entre a trombogenicidade real do dispositivo e os artefatos experimentais. Os métodos in vitro para avaliar a trombose em DVAs permanecem subutilizados e nenhum método padronizado existe até o momento. Ao oferecer um protocolo abrangente e um guia em vídeo, esperamos facilitar a adoção mais ampla de métodos de bancada.

Este método aborda um desafio técnico e ético no desenvolvimento de dispositivos médicos, reduzindo a dependência de testes em animais e melhorando a capacidade de detectar riscos de trombose no início do processo de desenvolvimento. Para começar, preencha o loop de teste com 150 mililitros de sangue. Elimine todo o ar preso no circuito.

Se estiver usando uma bomba de sangue de fluxo axial, gire-a para a posição vertical para liberar o ar por flutuabilidade. Se estiver usando uma bomba centrífuga, vire-a de cabeça para baixo e gire-a para garantir que nenhum ar fique preso nos caminhos de fluxo secundários. Bata suavemente nas superfícies da tubulação e do reservatório e aperte as bolhas de ar para desalojá-las.

Inspecione de perto as seções horizontais da tubulação e as junções entre a tubulação e os conectores para garantir que não haja bolhas de ar. Aperte a bolsa intravenosa para aproximar o nível do fluido da porção superior estreita. Em seguida, prenda a bolsa com um hemostático na linha de fluido para eliminar a interface fluido-ar e feche a torneira de ventilação.

Em seguida, feche a torneira no final das linhas de pressão. Remova o tubo do manômetro e conecte uma seringa de três mililitros. Abra a torneira e puxe de um a dois mililitros de fluido para a linha de extensão, aproximadamente quatro centímetros.

Feche a torneira, retire a seringa e reconecte o tubo do manômetro. Abra a torneira para permitir as leituras de pressão. Por fim, prepare a porta de amostragem usando uma seringa.

Em seguida, corte ou rasgue um lenço sem fiapos em três fragmentos iguais. Torça o canto de um fragmento para formar uma ponta e insira-o na porta de injeção para absorver o sangue residual. Torça o segundo fragmento.

Umedeça-o com soro fisiológico e insira a ponta úmida na porta para remover todo o sangue restante. Use o terceiro fragmento para absorver qualquer solução salina residual na porta. Agora inicie o dispositivo de assistência ventricular, ou VAD, em baixa velocidade e opere-o por cerca de cinco segundos para desalojar quaisquer bolhas de ar presas dentro da bomba.

Pare a bomba. Se aparecer alguma bolha no saco, repita a desaeração. Reinicie a bomba em baixa velocidade para circular o sangue no circuito.

Transfira um mililitro de heparina sódica, dois mililitros da solução preparada de cloreto de cálcio e 1,5 mililitros de EDTA em tubos separados. Para adicionar heparina ao sangue na alça, aspire 75 unidades de heparina em uma micropipeta e distribua-a em uma seringa de três mililitros, dispensando simultaneamente a pipeta e puxando o êmbolo da seringa sem derramar. Use a porta transversal da torneira de três vias para administrar substâncias no laço com uma seringa.

Gire a trava de isca macho na torneira de modo que a porta de injeção fique voltada para cima para prender as bolhas de ar na parte superior. Agora conecte a seringa à porta de injeção através da trava de isca com a porta voltada para cima e a seringa apontando verticalmente para baixo. Puxe o êmbolo da seringa para enchê-lo de sangue e misture a heparina com o sangue enquanto aspira o ar para a seringa.

Deixe as bolhas de ar subirem até o topo da seringa. Em seguida, injete a mistura no circuito, garantindo que nenhum ar entre. Transporte o sangue para dentro e para fora da seringa quatro a cinco vezes para garantir que o sangue heparinizado não fique confinado ao espaço na porta.

Para titular o tempo de coagulação ativado, ou ACT, do sangue na alça, primeiro adicione 750 microlitros de solução de cloreto de cálcio monomolar a 150 mililitros de sangue na alça. Para evitar a coagulação do sangue, injete rapidamente o fluido após remover o ar residual. Como alternativa, dilua o cloreto de cálcio na seringa com um mililitro de solução salina tamponada com tris para reduzir a coagulação prematura.

Depois de deixar o cloreto de cálcio injetado circular por pelo menos dois minutos, conecte uma seringa de um mililitro à porta de amostragem. Retire e descarte 0,5 mililitros de sangue residual para limpar o sangue estagnado da porta. Em seguida, conecte uma nova seringa de um mililitro à porta de amostragem e retire 0,5 mililitros de sangue para análise.

Meça o tempo de coagulação ativado usando um sistema de coagulação de sangue total no local de atendimento. Limpe o sample porta usando lenços sem fiapos, conforme demonstrado anteriormente. Consulte os valores de titulação para informar a concentração alvo de cloreto de cálcio.

Aumente gradualmente a concentração de cálcio para atingir um tempo de coagulação ativado de 300 segundos. Inicie o teste de trombose in vitro assim que o TCA de 300 segundos for alcançado no loop. Ajuste a bomba para a vazão e pressão desejadas modificando a velocidade do rotor e regulando a resistência usando o grampo Hoffman.

Meça o ACT a cada 15 minutos retirando uma amostra de sangue do loop e colocando uma gota de sangue no instrumento ACT, conforme demonstrado anteriormente. Se o TCA cair abaixo de 200 segundos, injete mais 25 unidades de heparina sódica na alça. Após uma hora, injete 1,5 mililitros de EDTA 0,5 molar na alça para inibir a coagulação adicional.

Deixe o EDTA circular e misture por dois minutos, depois pare a bomba. Usando hemostáticos, prenda a tubulação conectada à entrada e saída da bomba, posicionando as braçadeiras a três a quatro centímetros de distância das farpas de entrada e saída. Desconecte cuidadosamente a tubulação para liberar a bomba.

Em seguida, drene o sangue da bomba e o circuito de fluxo para um recipiente. Finalmente, pipete soro fisiológico através da entrada e saída da bomba para lavar qualquer sangue residual. A deposição de plaquetas foi consistentemente observada ao longo das raízes das pás nos protótipos da bomba.

O eletropolimento dos componentes de titânio eliminou a formação de trombos nessas áreas. O protótipo também tinha cooptação imperfeita na junção dos componentes da carcaça dianteira e traseira, resultando em uma fenda onde o sangue penetrava e coagulava. A lapidação e o polimento melhoraram o encaixe dos componentes e reduziram a formação de trombos.

Erros de procedimento e desexibição incompleta do loop podem introduzir artefatos. Nesse caso, um erro experimental durante a injeção de cloreto de cálcio desencadeou coagulação localizada, e o trombo resultante entrou na bomba centrífuga de Maglev, ocluindo o caminho do fluxo. Coágulos esféricos e frouxamente aderidos observados nas superfícies são frequentemente o resultado de bolhas de ar encapsuladas em coágulos.

Material estranho e detritos circulando na alça também foram encapsulados em trombos e aderidos às superfícies da bomba. Trombos em anel nas junções do conector da tubulação foram indicativos da faixa ideal de TCA durante o teste.