Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para edição do genoma por meio de microinjeção embrionária no mosquito A. aegypti usando a tecnologia CRISPR-Cas9.

O escopo de nossa pesquisa envolve o estabelecimento de linhagens de mosquitos geneticamente modificadas usando a tecnologia CRISPR-Cas9. O uso da tecnologia CRISPR-Cas9 para supressão populacional de mosquitos, PgSIT, bem como para o estabelecimento de sistemas de expressão binária para controle espaço-temporal da expressão gênica.

Obtivemos linhas knockout e knockin usando a tecnologia CRISPR-Cas9. Nossas linhas de knockin incluem a inserção do transativador QF que permite o controle espaço-temporal de genes a jusante, como marcadores fluorescentes, GFP, para marcação específica de tecido e repórteres de atividade neuronal, G-CaMP6.

O estabelecimento de novas linhagens mutantes de mosquitos permitirá uma compreensão mais profunda da função gênica e das implicações nervosas, fisiológicas e comportamentais. Isso pode levar ao desenvolvimento de novas maneiras de prevenir a transmissão de doenças transmitidas por mosquitos. Nosso laboratório desenvolveu a tecnologia para supressão da população de mosquitos que se baseia na tecnologia CRISPR-Cas9 para nocautear genes relacionados à fertilidade masculina e à viabilidade feminina. Além disso, estabelecemos várias linhagens de mosquitos para o estudo da resistência sensorial do mosquito, especificamente olfato e visão.

[Entrevistador] Para preparar a construção de injeção para mutantes knockout, dilua a proteína Cas9 até a concentração desejada usando o tampão de diluição Cas9. Em seguida, diluir a alíquota de RNA guia ou gRNA sintetizado in vitro com água ultrapura. Pré-misture a proteína Cas9 diluída com cada gRNA para formar um complexo de ribonucleoproteína. Em seguida, combine as várias soluções complexas de ribonucleoproteínas pré-misturadas. Para inserções de de genes mediadas por reparo dirigido por homologia, dilua e misture a proteína Cas9 e os gRNAs. Diluir o plasmídeo doador com água ultrapura e combinar todas as construções. Em seguida, use um filamento de quartzo para preparar as agulhas de microinjeção. Usando o seguinte programa. Puxe as agulhas com um extrator de micropipeta a laser. Depois de configurar um aspirador manual, umedeça os papéis de filtro de círculo branco e coloque-os na parede interna ou em cima do algodão úmido dentro do coletor. Coloque de cinco a 10 mosquitos fêmeas que foram alimentados com sangue de cinco a 10 dias atrás no coletor. Em seguida, coloque o coletor no escuro por 45 minutos. Depois, remova os mosquitos do coletor. Após a incubação, remova os papéis de filtro para colher os embriões. Selecione embriões em estágio pré-blastoderma que sejam cinza claro do papel de colheita. Transfira os embriões selecionados com um pincel úmido para fita adesiva dupla face colocada em cima de uma lamínula. Alinhe os embriões em paralelo, certificando-se de que estejam lado a lado com todas as extremidades posteriores voltadas para a frente enquanto o ambiente permanece úmido. Durante o alinhamento, adicione óleo de halocarbono 700 nos embriões para evitar a dessecação. No microinjetor, configure uma pressão de compensação de 300 hectopascais e uma pressão de injeção de 500 hectopascais. Usando um microcarregador, carregue três microlitros da construção de injeção em uma agulha. Coloque a lamínula com embriões alinhados numa lâmina de microscópio e posicione-a sob o microscópio para injeção. Em seguida, prenda uma agulha no porta-agulha com um micromanipulador em um ângulo de 10 graus em direção à extremidade posterior dos embriões. Abra a agulha suavemente tocando levemente sua ponta na borda da lamínula. Em seguida, injete o embrião com a construção do plasmídeo. Depois de injetar mosquitos Aedes agyptie com a construção de injeção, use lenços descartáveis sem fiapos para remover o óleo ao redor dos embriões. Adicione água deionizada para enxaguar os embriões. Transfira os embriões enxaguados para um papel de filtro úmido e coloque o papel de filtro em um lenço de papel úmido dentro de um copo de nove onças Karat. Em seguida, coloque algodão úmido no fundo do copo para manter a umidade. Depois de manter os embriões úmidos por três a quatro dias, transfira o papel de filtro com os embriões para aproximadamente três litros de água deionizada em uma panela Sterilite de seis litros para incubação. Assim que as larvas G zero eclodirem, adicione comida de peixe misturada com água à panela. Rastreie as larvas G zero para o marcador fluorescente no estágio larval do terceiro ao quarto ínstar. Separe as larvas com base em seu status fluorescente. Mantenha as larvas fluorescentes positivas e fluorescentes negativas em panelas separadas. Separe os mosquitos injetados por sexo quando eles se transformarem em pupas e identifique os machos por seu tamanho menor, lobo genital mais proeminente e pontiagudo e pás mais largas. Identifique as fêmeas por seu tamanho maior, lobo genital menos pronunciado e pás mais estreitas. Depois de agrupar mosquitos fluorescentes positivos ou negativos fluorescentes de cada sexo, cruze cada grupo com mosquitos do sexo oposto da cepa Liverpool A. agyptie do tipo selvagem em uma proporção de três a cinco indivíduos do tipo selvagem para cada indivíduo com tela fluorescente, permitindo que eles acasalem por quatro dias. Após três a quatro dias, rastreie as larvas G1 para o marcador fluorescente nos estágios larvais do terceiro ao quarto ínstar.