Name: Purificação do retículo sarco-endoplasmático Ca2+-ATPase do músculo de coelho (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a purificar a SERCA do músculo de coelho com alta pureza e atividade catalítica usando trealose. Este método melhora a estabilidade proteica para estudos estruturais e funcionais em bioquímica.

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Todos os procedimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes internacionais e locais (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) para o manejo de animais em laboratórios experimentais 51,67,68. O tecido muscular foi obtido de Oryctolagus cuniculus do tipo selvagem de uma unidade local de manejo de animais (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Um veterinário com experiência em manejo de animais de laboratório realizou a dissecção e processamento muscular inicial. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Isolamento do retículo sarcoplasmático do músculo de coelho de contração rápida (Timing, 7 - 9 h)
NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Champeil et al.69.
<ol>
	<li>Obtenha tecido muscular de contração rápida (~ 70 g de ambas as patas traseiras por animal) de Oryctolagus cuniculus do tipo selvagem. NOTA: É necessária a identificação visual prévia dos músculos a serem dissecados70,71.</li>
	<li>Macerar o músculo de contração rápida no liquidificador, suspendendo-o em três volumes de 100 mM de KCl, com 1 min ligado e 1 min em repouso gelado, repetir três vezes72.</li>
	<li>Remover os restos de tecido por centrifugação (1500 × g) a 4 °C durante 5 min; Uma segunda centrifugação (4200 × g) é realizada, se necessário.</li>
	<li>Colete o sobrenadante e homogeneize-o usando um triturador de tecidos (10 golpes em baixa velocidade, ou seja, 500-1.500 rpm)72,73. Centrifugar o homogeneizado (10.000 × g) a 4 °C durante 15 min. NOTA: Deve-se ter cuidado ao homogeneizar, pois o uso de uma velocidade relativamente alta pode resultar em danos ao sistema e ao operador.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante (contendo o retículo sarcoplasmático) (33.000 × g) a 4 °C durante 120 min.</li>
	<li>Suspender os pellets em 40 ml de sacarose 0,5 M e centrifugar (12.000 × g) a 4 °C durante 15 min. Diluir o sobrenadante (0,6 M de KCl e 0,15 M de sacarose) e centrifugar a suspensão (34.000 × g) a 4 °C durante 165 min.</li>
	<li>Suspenda o pellet contendo as folhas de vesículas do retículo sarcoplasmático (SRVs) em 0,3 M de sacarose, 0,1 M de KCl e 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de Lowry74 e albumina sérica humana como padrão de proteína.</li>
	<li>Alíquota dos SRVs (30-32 mg/mL) em volume de 1 mL. Armazene as amostras de SRVs a -72 °C para processamento posterior. NOTA: O rendimento proteico é de 100-110 mg SRVs por animal.</li>
</ol>
2. Purificação SERCA (Tempo, 18 - 20 h)
NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>Dilua a suspensão de SRVs para 2 mg de proteína / mL usando 75 mM gelados de Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M de KCl, 6 mM de EDTA, 1 mM de EGTA e 0,1% (p / v) desoxicolato (DOC). Incube a suspensão SRVs no gelo por 10 min e agitação suave. Centrifugue a suspensão SRVs (100.000 × g) a 4 °C por 60 min. NOTA: DOC deve ser adicionado gota a gota.</li>
	<li>Suspenda os pellets em &lt;3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M de KCl, glicerol a 45% (v/v) e 2 mM de EDTA. Homogeneizar a suspensão e ajustar para um volume final de 10 ml. Determine a concentração de proteína e, em seguida, ajuste-a para 6,5 mg / mL. Adicionar azolectina a 5 mg/ml e Zwittergent 0,85 (p/p) 3-14. NOTA: Azolectina e Zwittergent 3-14 devem ser adicionados gota a gota.</li>
	<li>Homogeneizar a suspensão e centrifugar (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min. Recolha o sobrenadante e dilua 1:2 com 2 mM de EGTA (pH 7,2).</li>
	<li>Despeje a suspensão suavemente em um gradiente de concentração de trealose descontínuo (45, 40, 35 e 30% p / v) em 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,1% de desoxicolato e 1 mg / mL de azolectina. Centrifugar (100.000 × g) a 4 °C durante 14 h. Recolha o pellet transparente e ligeiramente amarelado formado no fundo dos tubos. NOTA: Tanto a formação do gradiente de trealose como a adição da suspensão da amostra devem ser realizadas utilizando técnicas adequadas. Recomenda-se centrifugação durante a noite.</li>
	<li>Suspenda suavemente o pellet em um pequeno volume (&lt;1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45% de glicerol e 2 mM de EDTA. Determine a concentração de proteína. Ajustar a concentração de proteínas por diluição para 2 mg/ml. Pegue alíquotas (~ 50 μL) da suspensão e armazene o SERCA purificado a -72 ° C até seu uso.</li>
	<li>Execute SDS-PAGE do SERCA72 purificado e de amostras de proteínas colhidas em diferentes etapas da purificação. Manchar o gel com Coomassie Blue72. NOTA: O uso de trealose 0,6 M em vez de glicerol no tampão de suspensão aumenta a estabilidade da enzima durante os ciclos de armazenamento e congelamento e descongelamento28,29.</li>
</ol>
3. Ensaio para atividade de ATPase (tempo, 1 - 2 h)
<ol>
	<li>Ensaio acoplado a enzimas: ATPase-Piruvato quinase-lactato desidrogenase<ol>
		<li>Preparar a mistura de reacção (1 ml): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpiruvato, 250 μM NADH. Inclua concentrações variáveis de ATP (0,001 a 0,25 mM).</li>
		<li>Homogeneizar cuidadosamente o ensaio de reação por vórtice. Incube o ensaio de reação a 37 ◦C por 10 min. Adicione 0,9 U L-lactato desidrogenase (LDH) e 1,5 U piruvato quinase (PK).</li>
		<li>Inicie a reação ATPase pela adição de 10 μg de SERCA.</li>
		<li>Determine a formação de NADH. Acompanhe a mudança na intensidade da absorbância a cada segundo durante 600 s a um comprimento de onda (λ) de 340 nm ao longo do tempo usando um espectrofotômetro com um suporte de célula termostatizado. NOTA: O intervalo de tempo para a medição da absorbância pode variar, mas tente registrar o maior número possível de pontos de dados para desenhar a linha reta inicial da reação ATPase.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determine a taxa de hidrólise de ATP NOTA: Para detalhes sobre o procedimento, consulte Rivera-Morán et al.46.<ol>
		<li>Calcule o valor da inclinação (Δabs/min) da porção linear em cada curva formada. Use o coeficiente de extinção molar (ε) de NADH (λ = 6.220 M−1·cm−1) para determinar a atividade da ATPase (μmoles ATP hidrolisado/min.mg prot.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinar os parâmetros cinéticos Km e Vmáx
	<ol>
		<li>Plote os dados de velocidade versus concentração de ATP usando software de análise de dados e gráficos.</li>
		<li>Ajuste os dados por regressão não linear à Equação de Michaelis-Menten (Eq. 1)46: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> onde v é a velocidade, Vmax é a velocidade máxima, [S] é a concentração de ATP e Km é a constante de Michaelis-Menten.</li>
		<li>Determine Km e Vmax por iteração. NOTA: A inclusão de DOC pode aumentar a taxa de resposta da ATPase; recomenda-se testar diferentes concentrações de DOC para encontrar o ideal.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ensaio de marcação de SERCA com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (tempo, 30 - 45 min, apenas para marcação FITC)
NOTA: Para obter detalhes sobre o procedimento, consulte 54,75,76.
<ol>
	<li>Suspenda o SERCA (20 μg) em 50 μL (volume final) de tampão de marcação (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 e 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) contendo 1 mM de FITC. Misture por vórtice.</li>
	<li>Incube as amostras em momentos diferentes (15 min, 10 min, 7 min, 5 min e 2 min) no escuro e em temperatura ambiente.</li>
	<li>Pare a reação de marcação adicionando 1 volume de tampão de parada gelado (480 mM de sacarose e 48 mM de MOPS, pH 7,0), contendo ATP (5 mM). Incube no gelo por 5 min no escuro.</li>
	<li>Sujeito o SERCA rotulado com FITC à SDS-PAGE72. Exponha os géis transparentes à luz UV (λ = 302 nm). Foto: documente o resultado.</li>
	<li>Manchar o gel com azul Coomassie. Foto: documente o resultado. NOTA: Realizar a rotulagem FITC em uma sala escura pode melhorar a qualidade do sinal de fluorescência.</li>
</ol>
5. Espectros de dicroísmo circular (CD) (Tempo, 30 min)
NOTA: Para obter detalhes sobre o procedimento, consulte 11,77.
<ol>
	<li>Suspender SERCA (3 μM) em 400 μL de tampão fosfato 10 mM (pH 7,0) a 25 °C.</li>
	<li>Carregue a amostra em uma célula de 0,1 cm de comprimento de caminho. Defina a faixa λ dos espectros de UV distante entre 190-260 nm. Defina a resolução interna e a largura de banda para 1 nm.</li>
	<li>Registar o sinal de CD a 50 nm/min a 25 °C.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Azolectina de soja</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UV de bancada&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>A configuração alta de dupla intensidade é ideal para documentação analítica. A configuração baixa reduz o photonicking ou o fotobranqueamento de amostras de gel durante o trabalho preparativo.</td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Câmera Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie azul brilhante G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl maltoside</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N&prime;,N&prime; -ácido tetracético</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal tetrassódico di-hidratado&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecil-N,N-dimetil-3-amônio-1-propanossulfonato</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Músculo de coelho lactato desidrogenase</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Músculo de coelho piruvato quinase</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>Espectropolarímetro</td><td>Jasco Corp.</td><td>Jasco J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Trealose</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Cloridrato de Tris</td></tr><tr><td>(hidroximetil)aminometano</td> di-hidratado <td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV/VIS&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>O espectrofotômetro UV-Vis Agilent 8453 usa uma matriz de fotodiodos para medição simultânea do espectro completo de luz ultravioleta a visível</td></tr><tr><td>WiseStir HS- 30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Ideal para todas as aplicações de descongelamento e homogeneização, projetado para trituradores de tecidos.</td></tr></tbody></table>

purificação do retículo sarco-endoplasmático ca2+-atpase do músculo de coelho

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

SDS-PAGE de SERCA em diferentes estágios de purificação (Figura 1). O gel corado com azul de Coomassie mostra o enriquecimento da banda da proteína SERCA (peso molecular aparente &gt;100 kDa) à medida que o protocolo de purificação avança. A banda de proteína correspondente ao SERCA mostra uma pureza de &gt;90% após centrifugação em um gradiente de concentração de trealose. Gráfico da taxa de hidrólise de ATP versus concentração de ATP (Figura 2A). A ci...

Purificação do retículo sarco-endoplasmático Ca2+-ATPase do músculo de coelho

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

purification-sarco-endoplasmic-reticulum-ca2-atpase-from-rabbit

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

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Medindo o transporte de catiões de Na, K e H, K-ATPase em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos por espectrofotometria de absorção atômica: uma alternativa para Ensaios de Radioisótopos

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Mapeamento óptica de Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E Potencial Transmembrane no Coração Langendorff-perfundidos

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