Purificação do retículo sarco-endoplasmático Ca²⁺-ATPase do músculo de coelho

Nossa pesquisa se concentra na purificação de SERCA, com alta qualidade estrutural e atividade catalítica, enquanto investiga se a trealose estabiliza o SERCA durante a purificação, aumentando sua estabilidade e funcionalidade. A determinação da estrutura tridimensional das ATPases do tipo P em seus estados oligoméricos. O uso de inteligência artificial para modelagem estrutural de ATPases, simulações de dinâmica estrutural e acoplamento molecular de ligantes para explorar a terapêutica de doenças e melhorar a análise da função de proteínas e novas tecnologias. Os desafios atuais incluem a compreensão dos mecanismos de conversão de energia em P-ATPases, elucidando como a estrutura quaternária regula a função e a atividade e identificando inibidores eficazes para aplicação terapêutica em doenças humanas. Confirmamos o estado hexamérica da próton-ATPase da membrana plasmática GS e demonstramos sua dependência da dinâmica estrutural ou viscosidade do meio, conforme descrito pela teoria de Kramers.

[Narrador] Para começar, obtenha músculos de contração rápida do Oryctolagus cuniculus do tipo selvagem. Suspendê-lo em três volumes de cloreto de potássio 100 milimolar para maceração. Misture por um minuto, seguido de um minuto de descanso gelado. Centrifugue a amostra a 1.500 g a 4 graus Celsius por 5 minutos para remover os detritos de tecido. Recolha o sobrenadante num tubo e, em seguida, homogeneize-o com um triturador de lenços de papel. Em seguida, centrifugar o homogeneizado, seguido do sobrenadante. Suspenda os pellets em aproximadamente 40 mililitros de sacarose 0,5 molar. Agora, centrifugue a suspensão a 12.000 g a 4 graus Celsius por 15 minutos. Diluir o sobrenadante resultante em cloreto de potássio 0,6 molar e sacarose 0,15 molar antes de centrifugar. Suspenda o pellet contendo folhas de vesículas do retículo sarcoplasmático em um tampão contendo 0,3 molar de sacarose, 0,1 molar de cloreto de potássio e 5 milimolares de Tris-cloridrato em pH 7,0. Alíquota das vesículas do retículo sarcoplasmático em volumes de 1 mililitro. Incubar a suspensão da vesícula do retículo sarcoplasmático no gelo durante 10 minutos com agitação suave e, em seguida, centrifugar. Suspenda o pellet em menos de 3 mililitros de tampão cloridrato de Tris 25 milimolares. Depois de homogeneizar a suspensão, ajuste-a para um volume final de 10 mililitros com tampão cloridrato de Tris. Determine a concentração de proteína usando o ensaio de Lowry. Adicione azolectina a 5 miligramas por mililitros e, em seguida, adicione 0,85 Zwittergent 3-14. Homogeneizar novamente a suspensão e centrifugar a 100.000 g a 4 graus Celsius durante 60 minutos. Recolha o sobrenadante num novo tubo. Dilua-o na proporção de 1 para 2 com 2 milimolares EGTA a pH 7,2. Despeje a suspensão suavemente em um gradiente de concentração de trealose descontínuo no tampão Tris. Em seguida, centrifugue como antes e recolha o pellet transparente ligeiramente amarelado. Suspenda o pellet suavemente em um pequeno volume de tampão Tris. Meça a concentração de proteína e dilua-a para ajustar a concentração de proteína para 2 miligramas por mililitro. Para a atividade da ATPase, prepare 1 mililitro da mistura de reação. Vortex o ensaio de reação para homogeneizar e, em seguida, incube-o a 37 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 0,9 unidades de L-lactato desidrogenase e 1,5 unidades de piruvato quinase. Adicione 10 microgramas de SERCA para iniciar a reação da ATPase. Monitore a mudança de absorbância a cada segundo por 600 segundos a 340 nanômetros com um espectrofotômetro que possui um suporte de célula termostática para determinar a formação de NAD. Para o ensaio de marcação de SERCA com isotiocianato de fluoresceína, ou FITC, primeiro suspenda 20 microgramas de SERCA em 50 microlitros de tampão de marcação. Vórtice para misturar bem. Em seguida, incube as amostras no escuro em temperatura ambiente por 15, 10, 7, 5 e 2 minutos. Para interromper a reação de rotulagem, adicione um volume igual de tampão de parada gelado. Incube no gelo no escuro por 5 minutos. Sujeite o SERCA rotulado com FITC ao SDS-PAGE. Exponha os géis transparentes à luz ultravioleta em um comprimento de onda de 302 nanômetros e fotodocumente o resultado. Por fim, pinte o gel com azul Coomassie. Fotodocumente o resultado. Para análise de espectros de dicroísmo circular, primeiro suspenda o SERCA em 400 microlitros de tampão fosfato 10 milimolar de pH 7,0 a 25 graus Celsius. Carregue a amostra em uma célula com comprimento de caminho de 0,1 centímetros. Agora, defina a faixa de espectros ultravioleta distantes entre 190 e 260 nanômetros e a resolução interna e largura de banda para 1 nanômetro. Registre o sinal de dicroísmo circular a uma velocidade de 50 nanômetros por minuto a 25 graus Celsius. O gel SDS-PAGE corado com azul de Coomassie demonstrou o enriquecimento da banda da proteína SERCA à medida que a purificação progredia. A etapa final de purificação do SERCA usando ultracentrifugação em um gradiente de concentração de trealose resultou em uma pureza superior a 90%. As vesículas do retículo sarcoplasmático continham uma grande quantidade de SERCA, com aproximadamente 73% da proteína total nas vesículas correspondendo a esta P-ATPase. Um padrão cinético de Michaelis-Menten foi observado para o SERCA purificado na curva de taxa de hidrólise de ATP versus concentração de ATP, confirmando sua funcionalidade enzimática. O gráfico de Lineweaver-Burk revelou uma constante de Michaelis de aproximadamente 10 micromoles para ATP, consistente com os valores relatados anteriormente. A marcação FITC de SERCA indicou um sítio de ligação de nucleotídeo intacto. A banda SERCA manchada de azul de Coomassie correspondia exatamente à banda rotulada com FITC. A espectroscopia de dicroísmo circular confirmou a alta qualidade estrutural do SERCA purificado, com seu espectro indicando elementos de estrutura secundária bem definidos.