Extração e Limpeza de Tecidos Preparação de Amostras de Cérebro-Medula Espinhal de Camundongos

Nossa pesquisa se concentra em como o sistema nervoso central medeia as funções cognitivas e interage com o sistema imunológico. Nosso objetivo é melhorar os métodos de exame do cérebro e da medula espinhal, abordando as questões fundamentais sobre essas interações. Esses métodos mantêm todo o cérebro e a medula espinhal intactos, o que nos ajuda a mapear a célula mais detalhadamente usando a limpeza do tecido. Também torna o processo mais rápido e preciso, reduzindo o tempo e os erros em comparação com os métodos tradicionais de seccionamento e imagem.

Mapeamos o cérebro e as regiões da medula espinhal conectadas aos pulmões produzindo. Nossa pesquisa se concentrará em explorar a comunicação neuroimune entre o cérebro, a medula espinhal e os pulmões. E como essa interação influencia as respostas imunológicas.

[Instrutor] Para começar, fixe os membros do mouse na placa larga de acrílico usando grampos de aço. Usando uma tesoura, corte a pele entre os dois fêmures e continue cortando para cima até chegar ao diafragma. Abra os dois lados do tórax através do diafragma, usando uma tesoura e uma pinça reta para expor o coração. Insira uma agulha de infusão de 0,7 milímetro presa a um tubo de perfusão no ventrículo esquerdo e faça uma incisão de um a dois milímetros no apêndice atrial direito. Após a perfusão, separe a pele do dorso e da cabeça do camundongo usando uma tesoura oftálmica. Corte a coluna no ponto em que a linha que conecta as bordas traseiras superiores de ambos os membros se cruza com a coluna vertebral. Remova o músculo e o tecido adiposo do pescoço e das costas do mouse para expor a coluna e o crânio. Com uma tesoura venosa, corte ao longo da lacuna da linha média entre os lados esquerdo e direito da coluna e da medula espinhal a partir da extremidade inferior do canal vertebral. Em seguida, remova a parte superior e os lados bilaterais da coluna cortada para expor a medula espinhal. Repita os passos até chegar à conexão com o cérebro. Coloque a ponta de uma lâmina da tesoura venosa entre o forame magno e o cérebro. Deslize e corte ao longo da sutura sagital mediana para abrir o crânio. Use uma pinça para remover o crânio e expor o cérebro. Agora, usando fórceps e tesoura venosa, remova o tecido da medula espinhal do cérebro do camundongo da extremidade craniana. Use uma pinça de dissecação para remover a membrana da medula espinhal sob o microscópio estereoscópico. Em seguida, com suturas, prenda a amostra da medula espinhal cerebral à placa de fixação. Adicione pelo menos 20 vezes o volume da amostra de paraformaldeído a 4%. Após a fixação, descartar o paraformaldeído e lavar a amostra três vezes com PBS. Para começar, fixe a medula espinhal do cérebro do camundongo extraída em paraformaldeído. Para a solução de remoção de lipídios, misture as soluções A e B em uma proporção de massa de nove para um. Adicione 50 mililitros da solução de remoção de lipídios a um tubo de centrifugação de 50 mililitros e coloque o tecido fixado nele. Após a incubação na solução C, mudar a solução e colocar a placa de cultura com a amostra totalmente imersa na solução C numa caixa leve com uma linha de escala. Para preparar a solução em gel, adicione 147 gramas da solução C e três gramas de agarose a um frasco de vidro de 200 mililitros. Misture bem os componentes com uma vareta de agitação e leve ao microondas até que a agarose se dissolva. Transfira a solução de gel para um forno de laboratório regulado para 37 graus Celsius. Despeje uma camada de dois milímetros de profundidade de solução de gel temperado a 37 graus Celsius no molde e resfrie-o em uma geladeira de quatro graus Celsius por 30 minutos até que esteja semi-sólido. Coloque a amostra correspondente ao índice de refração no molde e adicione a solução de gel até o nível ou ligeiramente abaixo do topo da amostra. Coloque o molde de volta na geladeira de quatro graus Celsius por duas horas. Cubra com uma lamínula e leve à geladeira novamente. Remova a lamínula com uma pinça e retire a amostra incorporada. Adicione 30 mililitros de solução de imagem a um tubo de 50 mililitros e mergulhe a amostra na solução. Aplique o adesivo 502 para fixar firmemente a amostra no suporte de amostra, antes de fixar o suporte no dispositivo de imagem. Execute o software de digitalização e selecione o nível de ampliação de 4X na seção de ampliação. Clique no botão de calibração para ativar o modo de calibração. Clique no botão de visualização para entrar no modo de visualização. Em seguida, clique no botão de movimento na direção Z para mover lentamente a amostra para cima a partir da parte inferior da câmara de amostra até que a folha de luz gerada passe pela amostra. Selecione o canal de laser apropriado e a opção de modo de iluminação. Selecione a direção do caminho de varredura para a amostra. Clique no botão de varredura automática para começar a capturar as imagens da amostra. O protocolo preservou com sucesso todo o cérebro e a medula espinhal do camundongo, mantendo intactos os sinais fluorescentes para imagens claras. A imagem fluorescente da amostra da medula espinhal cerebral visualizou claramente estruturas neurais detalhadas. Imagens de maior ampliação forneceram visualização aprimorada de células individuais marcadas com fluorescência.