Um método eficiente para extrair o epitélio da trompa de Falópio humano para análises de célula única

Nosso foco de pesquisa é entender e combater a resistência à quimioterapia em cânceres de ovário. Nosso objetivo é descobrir mecanismos e subpopulações celulares que impulsionam a resistência e novos alvos para erradicar essas populações agressivas.

O sequenciamento de RNA de célula única facilita a caracterização de subpopulações em tumores ovarianos heterogêneos. Aproveitamos as células epiteliais das trompas de Falópio não cancerosas como uma célula de origem normal para análises de câncer de ovário.

O isolamento eficiente das células epiteliais das trompas de Falópio em uma suspensão unicelular enriquecida ajudará a entender melhor o início da doença do câncer de ovário seroso de alto grau. Esta técnica de digestão mecânica e enzimática oferece um processo mais eficiente para extrair uma suspensão unicelular enriquecida de células epiteliais viáveis da trompa de Falópio.

[Narrador] Para começar, colete trompas de falópio humanas frescas em um tubo de 15 ou 50 mililitros contendo meios de dissociação e coloque o tubo no gelo. Transferir as trompas de Falópio para uma placa de Petri estéril contendo meios de dissociação frescos e colocar a amostra sob um microscópio de dissecação. Agora, usando uma pinça de ponta fina e uma tesoura Vannas-Tübingen, disseque a gordura, o tecido conjuntivo e quaisquer vasos ao redor dos tubos. Em seguida, corte o plano coronal das trompas de Falópio com uma tesoura para formar pequenos cilindros com três a cinco milímetros de diâmetro. Use uma pinça fine=point para estabilizar o tecido durante o corte. Aspirar cuidadosamente o meio de dissociação da placa que contém os pedaços de tecido. Lave os pedaços de tecido duas vezes com dois mililitros de PBS 1x frio e gire levemente a placa. Depois de aspirar o PBS, incubar os pedaços de tecido por cinco minutos em EDTA frio de cinco milimolares à temperatura ambiente. Suspenda os fragmentos de tecido em solução salina balanceada fria de tripsina Hanks a 1% e incube a quatro graus Celsius por 40 minutos. Aspire a solução salina balanceada de tripsina Hanks a 1% e lave os pedaços de tecido duas vezes em meio de dissociação fria para inativar a tripsina. Incubar os fragmentos de tecido em dois mililitros de meios de dissociação com 0,4 miligramas de DNase por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Sob um microscópio de dissecação ainda em meio DNase, segure um fragmento da trompa de Falópio com uma pinça de modo que o lúmen fique paralelo ao fundo do prato. Use uma pinça para pressionar repetidamente o tecido para expelir as células epiteliais do lúmen. Confirme a liberação de um halo de células ao redor do tecido. Transfira as células que contêm o meio para um tubo estéril de 15 mililitros. Lavar a placa de Petri duas vezes com meios de dissociação e combinar as lavagens no mesmo tubo. Descarte os fragmentos restantes do tubo estromal. Para colher as células, centrifugue-as a 500g por cinco minutos. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um mililitro de meio de dissociação. Agora, misture 10 microlitros de suspensão celular com um volume igual de azul de tripano. Pipete 10 microlitros da mistura em uma lâmina de contagem de câmara e insira-a em um contador de células para determinar a contagem de células. Ressuspenda as células em nove mililitros de meios de dissociação contendo colagenase tipo um e DNase. Incube a 37 graus Celsius por 30 a 45 minutos em um agitador orbital ajustado para 200 RPM. Para colher as células, centrifugue a 500g por cinco minutos. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de meio de dissociação para lavar a colagenase. Passe a suspensão celular por um filtro de células de 100 micrômetros para um tubo de 50 mililitros e centrifugue o filtrado a 500g por cinco minutos. Se o pellet celular parecer vermelho, prepare um tampão de lise de hemácias para lisar os glóbulos vermelhos. Aspirar o meio do sedimento, adicionar cinco mililitros do tampão de lise de eritrócitos diluído e incubar a amostra em gelo durante três minutos. Para interromper a lise de hemácias, adicione 45 mililitros de 1x PBS ao tubo. Centrifugue o tubo a 500g por cinco minutos. Após colher e ressuspender as células em um mililitro de meio de dissociação, misture 10 microlitros da suspensão celular com um volume igual de azul de tripano. Pipete 10 microlitros da mistura em uma lâmina de contagem de câmara e insira-a no contador de células. A análise por citometria de fluxo confirmou o isolamento de uma população de células epiteliais viável e enriquecida do tecido da trompa de Falópio com viabilidade média de 82%. Depois de retirar as células imunes CD45 positivas, as células epiteliais positivas para EpCAM compreenderam uma média de 80% da amostra, enquanto a contaminação das células estromais CD10 positivas foi mínima em 7,8%. Células epiteliais isoladas formaram aglomerados aderentes semelhantes a paralelepípedos em cultura 2D após quatro a seis dias de plaqueamento, confirmando a identidade epitelial. A imunoquímica revelou que a maioria das células cultivadas expressou EpCAM e PAX8 com apenas algumas células positivas para vimentina. Células ciliadas estavam presentes na cultura.