Name: Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: Aprenda triagem de pequenas moléculas em larvas de Danio rerio com avaliação morfológica por microscopia estereoscópica. Este método permite identificar fenótipos anormais e avaliar toxicidade em biologia do desenvolvimento.

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<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
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<li>Huang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bone+transgenic+zebrafish+in+anti-osteoporosis+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening.</a> Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
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<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L (P10)</td><td>Gilson</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>20/10 e micro; Ponteira de pipeta L</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; L (P1000)</td><td>Gilson</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 12 poços</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>Estéril, embalada individualmente, não tratada, com tampa</td></tr><tr><td>20 &micro; L (P20)</td><td>Gilson</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L (P200)</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L pipeta multicanal&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Ponteiras de pipeta L</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 poços</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>Estéril, embalada simples, fundo plano, não tratada, com tampa</td></tr><tr><td>Tanques de reprodução com fundo inclinado de grade interna, divisórias de tanque e tampas</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>Tanque interno inclinado</td></tr><tr><td>Filtro de malha</td><td>/</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Luvas de nitrilo</td><td>Mercator</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Placa de Petri&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm ou 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA Microscópio estereofónico de fluorescência</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada a peltier incluindo 2 prateleiras com módulo de luz branco frio</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>Equipado com ciclo</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> dia/noite <tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td><td>Para preparar uma solução a 1% em E3</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>Para preparar E3</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td><td>Para preparar E3</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>316030500</td><td>Para preparar E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&nbsp; Biblioteca Wnt Pathway (Bosutinibe)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>Para preparar E3</td></tr></tbody></table>

triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

As anormalidades podem ser analisadas individualmente ou cumulativamente ao longo do cronograma experimental até 7 dpf. A pontuação morfológica máxima por anormalidade pode ser usada para calcular anormalidades morfológicas como uma porcentagem do número de larvas usadas. Por exemplo, se no dia 7 os escores da morfologia do edema pericárdico estiverem em 19 e 20 para os pontuadores 1 e 2, respectivamente, de uma pontuação possível de 24, o que significa que 19 ou 20 larvas de 24 apresentam edema pericárdico, a pontuação percentual pode ser calculada como:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
A Tabela Suplementar S1 mostra os resultados da pontuação morfológica (de ambos os pontuadores) a 4 dpf após o teste de toxicidade para o composto Bosutinibe, um inibidor da tirosina quinase indicado para o tratamento da leucemia mieloide crônica15. A mesma pontuação morfológica é repetida para peixes expostos com idade de 5 dpf a 7 dpf. O composto foi testado usando uma faixa de concentração de 100 μM a 6,25 μM. Três repetições técnicas foram conduzidas em diferentes momentos, e a taxa média de mortalidade cumulativa a 7 dpf foi usada para determinar a CL50, a concentração na qual 50% das larvas sobrevivem. O LC50 pode ser determinado em qualquer ponto de exposição. No entanto, recomendamos calcular isso em 7 dpf.
A mortalidade média acumulada em 7 dpf foi usada para gerar uma curva de CL50 , que pode ser vista na Figura 3. Para o Bosutinibe, a concentração de LC50 foi estimada em 37,95 μM.
NOTA: Esta concentração estimada de LC50 aplica-se estritamente a este sistema modelo e pode então ser usada para outros ensaios de fenotipagem a jusante.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
Figura 1: Esquema da triagem de drogas proposta em larvas a 3-7 dpf. As placas de teste de 96 poços são configuradas para a investigação de cinco concentrações que variam de 100 μM a 6,25 μM para o composto Bosutinibe. Abreviatura: dpf = dias após a fertilização. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
Figura 2: Defeitos morfológicos representativos observados em larvas de peixe-zebra a 5 dpf expostas a várias concentrações químicas (2 dias após a exposição). (A) Peixe-zebra controle (não afetado), (B) Larva de peixe-zebra com edema pericárdico leve, (C) Peixe-zebra com edema pericárdico grave e hemorragia na gema, (D) Peixe-zebra com atraso no desenvolvimento, pigmentação reduzida, bexiga natatória pequena, (E) Peixe-zebra com gema inchada e barbatana caudal dobrada, (F) Peixe-zebra com ausência de barbatana caudal, (G) Peixe-zebra com notocorda curva, (H) Peixe-zebra com cauda truncada, e (I) Peixe-zebra morto com necrose. Os defeitos são observados com pontas de setas vermelhas. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
Figura 3: Curva CL50 mostrando concentração em relação à % de mortalidade. As cinco concentrações testadas foram 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM e 6,25 μM, com % de mortalidade de 100%, 100%, 29,2%, 12,5% e 12,5%, respectivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Defeitos morfológicos</td>
			<td>Descrição</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Edema pericárdico</td>
			<td>Acúmulo de líquido ao redor do coração com um coração esticado e mau funcionamento da circulação sanguínea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Batimentos cardíacos (por minuto)</td>
			<td>Número reduzido de batimentos por minuto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gema</td>
			<td>Presença ou ausência de edema vitelino ou hemorragia que pode ocorrer simultaneamente com defeitos cardíacos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extensão da gema</td>
			<td>Gema inchada, fina ou ausente</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Notacorda curva</td>
			<td>Presença de notocorda dobrada ou ondulada e/ou cauda curva</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bexiga natatória</td>
			<td>Presença, ausência ou desenvolvimento parcial da bexiga natatória</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigmentação</td>
			<td>Menos ou nenhum melanócito em comparação com os peixes não tratados da mesma idade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Necrose</td>
			<td>Presença (leve ou grave) ou ausência de necrose em qualquer parte do corpo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desenvolvimento atrasado</td>
			<td>Desenvolvimento atrasado ou estagnado em comparação com controles do tipo selvagem da mesma idade.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resposta ao toque</td>
			<td>Resposta atrasada ou nenhuma resposta após um sobressalto (por exemplo, usando uma ponta de pipeta)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Truncamento</td>
			<td>Ausência do corpo posterior do peixe-zebra (ou seja, formação da cauda)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbatanas</td>
			<td>Presença ou ausência da nadadeira caudal que pode ser acompanhada por extensão fina da gema</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eixo do corpo reduzido</td>
			<td>Peixes que parecem normais, mas quando medidos são mais curtos em comprimento</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Uma lista de defeitos morfológicos visuais que podem ser observados após estudos de exposição a medicamentos.
Tabela Suplementar S1: Resultados morfológicos representativos para Bosutinib a 4 dpf (1 dia após a exposição). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Grande Escala Zebrafish-Based In vivo Tela pequena molécula

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Facilitar Drug Discovery: um ensaio automatizado de alta Inflamação conteúdo em Zebrafish

Neste artigo, embriões de peixe-zebra são usados para triagem de toxicidade química. A toxicidade química está correlacionada com as leituras de fenótipo. O protocolo de amostra mostra uma abordagem metodológica para a realização da triagem de toxicidade química.

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