Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Para começar, reúna embriões de peixe-zebra em estágio inicial três dias após a fertilização em uma placa de Petri. Com uma micropipeta de 1000 microlitros ajustada para um volume de 100 microlitros, transfira um embrião eclodido de aparência saudável para cada poço de uma placa de 96 poços. Pipetar agora a quantidade necessária do produto químico em estudo para cada alvéolo de uma placa de 12 poços.

Em seguida, ajuste o volume total para 2,4 mililitros com o meio E3. Preparar o comando do veículo de acordo com o solvente utilizado para dissolver o produto químico em estudo. Com uma pipeta de 200 microlitros, remova qualquer solução E3 existente de cada poço da placa de 96 poços.

Use uma micropipeta de oito canais para substituí-la por 100 microlitros do meio de teste preparado para cada concentração. Certifique-se de que um total de 24 larvas seja testado por concentração. Após 24 horas, use um microscópio de luz estéreo para realizar a pontuação morfológica.

Pontue a morfologia usando um método binário, onde ausente indica morfologia normal e presente indica uma anormalidade morfológica. Quando a pontuação estiver concluída, remova 50 microlitros do meio de cada poço. Substitua-o por 50 microlitros de meio de teste recém-preparado.

Remova e registre todas as larvas mortas e, em seguida, incube as larvas a 28,5 graus Celsius com um ciclo de luz de 14 horas e escuro de 10 horas. O peixe-zebra cinco dias após a fertilização exibiu diversos fenótipos após dois dias de exposição à droga. Peixes-zebra não afetados foram observados como normais, enquanto edema pericárdico leve foi evidente em alguns peixes.

Edema pericárdico grave, acompanhado de hemorragia vitelina e extensão da gema foi observado em outros. Atraso no desenvolvimento com redução da pigmentação, bexiga natatória e comprimento total também foi observado. Fenótipos adicionais incluíram peixe-zebra com gema inchada e barbatana caudal dobrada, barbatana caudal ausente e notocorda curva.

Os casos graves exibiram truncamento e óbito com necrose.