Método de alto rendimento para observação de fenótipos de motilidade em Pseudomonas aeruginosa

Nossa pesquisa foca em entender como as bactérias funcionam e causam infecção usando biologia de sistemas e genômica. Nosso objetivo é identificar os genes que influenciam a fisiologia bacteriana em condições que imitam o ambiente de infecção, a fim de encontrar novos alvos para o desenvolvimento de melhores antibióticos e tratamentos alternativos. Desenvolvemos um protocolo de alta capacidade para identificar fatores genéticos que influenciam a motilidade da Pseudomonas aeruginosa, possibilitando a análise genômica em todo o genoma dos comportamentos de enxame e espasmos. Essa iniciativa de pesquisa revelou mecanismos moleculares que impulsionam a motilidade e também contribuem para a formação de biofilmes, colonização e evasão da defesa do hospedeiro.

É adaptável a diferentes ensaios e espécies bacterianas. Para começar, pegue as placas de origem da biblioteca de mutantes transposões Pseudomonas aeruginosa e deixe-as planas sobre uma superfície em temperatura ambiente por aproximadamente uma hora para esfriar. Para o ensaio desejado, selecione placas de glicose M9 0,5% de ágar para enxame e placas LB agar 1% para espasmos.

Para configurar o replicador para transferência precisa da colônia, ative o replicador. Na seção selecionar e operar modo, escolha selecionar e executar programas armazenados. Na seção selecione as placas de origem, selecione mais a placa 384 agar.

Depois, na seção selecionar placa-alvo, selecione mais placa 384 agar. Na seção selecione os blocos, selecione o pino curto 384. Nos programas de cantor, selecione replicar muitos, depois vá para replicar opções de programa e escolha geral, reciclar e nenhum.

Na fonte da seção, selecione deslocamento, depois aleatório e raio padrão. No alvo da seção, selecione fixar e ajuste a pressão para 2%. Deixe todas as outras configurações como padrão. Depois, insira o pino curto RePads 384 no compartimento apropriado.

Posicione as placas de origem e alvo na plataforma designada do replicador. Coloque as placas fonte de densidade 384 e as placas vazias de motilidade na plataforma. Pressione run usando os parâmetros selecionados para iniciar o processo de transferência.

O robô de fixação de matrizes microbianas transferirá colônias das placas fonte de densidade 384 para as placas de motilidade. Em seguida, coloque as placas de motilidade inoculadas em sacos plásticos. Coloque cuidadosamente os sacos contendo os pratos na incubadora, ajustados a 37 graus Celsius por 18 horas.

Após o período de incubação, capture imagens de alta resolução das placas de motilidade usando qualquer software de imagem de alta qualidade. Após realizar o ensaio de motilidade e imaginar as placas de motilidade, execute o macro no ImageJ. Abra a pasta contendo as imagens para carregar o lote para análise.

Quando solicitado, modifique o ângulo usando a opção de pré-visualização até que a placa fique reta para ajustar a rotação da placa. Quando estiver satisfeito, clique no botão ok. Depois, mova a ferramenta retangular ao redor das colônias para cortar a parte da placa que contém as colônias.

Quando estiver pronto, clique em ok para completar o recorte. Defina a grade usada para desenhar a região de interesse, ou ROI, ao redor de cada colônia e meça a área de motilidade. Selecione a densidade adequada de colônias e ajuste os parâmetros conforme necessário para garantir que cada círculo esteja posicionado ao redor de uma colônia.

Quando estiver pronto, ative a caixa de aceitação e clique no botão de aceitar. A área de motilidade de cada colônia será medida, e um arquivo CSV contendo os dados será salvo na pasta designada. Para o ensaio de motilidade, autoclave uma solução de ágar contendo M9, glicose, ácidos casamino e sulfato de magnésio.

Despeje 25 mililitros do ágar resfriado e misturado em cada placa de Petri. Em seguida, inocule cada placa com 2,5 microlitros de cultura bacteriana durante a noite e incube a 37 graus Celsius por 18 horas com as pálpebras voltadas para cima para observar fenótipos de motilidade. Após autoclavar uma solução de LB com 1% de agar, despeje 25 mililitros do LB 1% de ágar resfriado e misturado em placas de Petri.

Esfaqueie bactérias inoculando na base das placas que contêm 1% de agar. Incube as placas a 37 graus Celsius por 48 horas e depois em temperatura ambiente por mais 48 horas. Após a incubação, retire cuidadosamente o ágar das placas.

Visualize a zona de contração tingindo a placa de Petri com solução de violeta cristalina a 1%. O ensaio de motilidade de contração mostrou que mutantes de Pseudomonas aeruginosa com deleções genéticas da maquinaria T4P apresentavam regiões de halo significativamente menores em comparação ao tipo selvagem, indicando uma motilidade reduzida dos espasmos. A análise de motilidade por enxame revelou que mutantes de deleção da biblioteca PA14 apresentaram regiões de halo significativamente reduzidas sem protuberâncias, confirmando a capacidade defeituosa de enxame.

Estudos de motilidade bacteriana geralmente são limitados pelo seu fluxo de produção. Nosso protocolo de motilidade de alta produtividade ajudará os pesquisadores a estudar a motilidade bacteriana de forma abrangente. Por exemplo, usando uma coleção de mutantes em todo o genoma, torna-se possível identificar todos os genes ligados à motilidade e revelar como as bactérias causam infecções.

Nossas descobertas levantam novas questões sobre o controle genético da motilidade em Pseudomonas aeruginosa, seu papel na formação de biofilmes e sua conexão com a patogênese. Eles também ajudam na exploração de como as condições ambientais moldam os comportamentos de motilidade e se o direcionamento dos genes de motilidade pode levar a terapias antimicrobianas inovadoras.