Otimizando a entrega de vesículas extracelulares usando um andaime bioimpresso em 3D com bainha central para tratamento de feridas crônicas

O escopo da pesquisa é desenvolver um projeto avançado de curativo bioativo para o tratamento eficaz de feridas crônicas. O andaime garantirá o controle, a degradação e a entrega local eficiente de vesículas extracelulares.

O protocolo atual visa superar a limitação do curativo convencional no tratamento da inflamação crônica. Em particular, a falta de controle, degradação e liberação oportuna de vesículas extracelulares.

Este protocolo oferece uma abordagem ajustável para fornecer agentes terapêuticos, incluindo genes, em tempo hábil para várias aplicações.

Todos os resultados fornecem novos insights sobre a personalização de um andaime para vários tipos de feridas e o aprimoramento das terapias regenerativas, carregando vesículas extracelulares com moléculas bioativas específicas.

Nosso laboratório vai construir uma plataforma de pesquisa translacional para abordar a cicatrização de feridas diabéticas.

[Narrador] Para começar, descongele rapidamente um frasco de células-tronco mesenquimais em um banho-maria a 37 graus Celsius. Remova o frasco quando restar um pequeno fragmento de gelo. Transfira todo o conteúdo do frasco para células estaminais mesenquimais para um tubo cónico de 15 mililitros contendo meio completo. Centrifugue as células a 200 G por cinco minutos à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em um mililitro de meio completo pré-aquecido. Em seguida, transfira as células para um frasco T25 contendo quatro mililitros de meio completo. Incline suavemente o balão T25 para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente. Incubar o balão a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 70% a 80% de confluência, aspirar o meio gasto do balão T25. Adicione três mililitros de PBS fresco ao frasco para remover quaisquer células residuais. Em seguida, adicione um mililitro de solução de tripsina a 0,25% ao frasco e incube. Monitore o descolamento celular ao microscópio com ampliação de 4x. Agora adicione quatro mililitros de meio pré-aquecido e completo ao frasco e pipete para cima e para baixo sobre a superfície até um descolamento. Em seguida, transfira a suspensão celular para uma centrífuga de 15 mililitros dois. Após a centrifugação, ressuspenda o pellet celular em meio fresco e completo e conte as células. Em seguida, transfira as células para um frasco T75 com uma densidade de semeadura de 5.000 células por centímetro quadrado. Incubar o balão T75 a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 72 horas, coletar o meio condicionado das células para isolamento da vesícula extracelular. Para isolar as vesículas extracelulares ou EVs, centrifugue os 13 mililitros de meio condicionado coletado a 800 G por 15 minutos para remover os detritos celulares. Use um filtro de seringa de 0,22 micrômetro para filtrar o sobrenadante e remover partículas grandes. Agora adicione cinco mililitros de tampão de precipitação ao meio condicionado filtrado. Vortex a mistura completamente para garantir que seja homogênea. Incube a mistura durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que as vesículas extracelulares precipitem. Em seguida, centrifugue a mistura a 3.220 g por 30 minutos a 20 graus Celsius. Garantir que os tubos estejam equilibrados. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e centrifugar novamente durante cinco segundos. Agora suspende suavemente o pellet EV em 200 microlitros de PBS para evitar danificar as vesículas. Realize western blotting para detectar marcadores específicos de vesículas extracelulares, incluindo CD63, CD81 e CD9. Prepare uma solução fresca de alginato de sódio a 4,5% em água ultrapura estéril. Agite a solução durante a noite a 60 graus Celsius para garantir a dissolução completa. Em seguida, dissolva a carboximetilcelulose em água ultrapura estéril para obter uma solução de 3,8%. Centrifugue as tintas biológicas preparadas a 3.220 G por 10 minutos a 25 graus Celsius para remover bolhas que possam interferir no processo de impressão. Agora use um misturador de seringas e misture três mililitros da solução preparada de alginato de sódio com EVs marcados ou o controle Dialymmi. Misture bem suavemente para garantir uma suspensão uniforme. Use outro misturador de seringa para combinar um mililitro de carboximetilcelulose com solução de alginato liase recém-preparada em água ultrapura estéril para atingir uma concentração final de 0,5 miliunidades por mililitro. Carregue simultaneamente a tinta biológica EV de alginato de sódio na parte central e a biotinta de alginato de carboximetilcelulose liase na parte da bainha da configuração da seringa. Inicie o software da impressora biológica 3D. Selecione uma forma cilíndrica com um padrão de preenchimento diagonal para criar a estrutura do andaime. Defina o diâmetro do cilindro para 20 milímetros e a altura para 1,1 milímetros. Configure o tamanho do poro para um milímetro. Defina as velocidades de bombeamento do núcleo e do bico da bainha para um milímetro por segundo com uma espessura de 0,25 milímetros por camada. Configure a velocidade de movimento para seis milímetros por segundo e imprima quatro camadas em temperatura ambiente. Use um umidificador com cloreto de cálcio em aerossol para reticular o andaime durante o processo de extrusão. Comece a imprimir o andaime em filme de poliéster. Posicione o bico do umidificador a aproximadamente 20 centímetros de distância do cabeçote de extrusão para garantir uma reticulação eficaz. Mergulhe o andaime em solução de cloreto de cálcio a 2.2% por 10 minutos para completar a reticulação. Enxágue o andaime três vezes com água ultrapura estéril para remover o excesso de cloreto de cálcio e tinta biológica não ligada. Raspe a pele dorsal de um camundongo diabético OCTA anestesiado com um aparador elétrico, evitando irritação ou lesão da pele. Agora crie uma ferida cutânea circular de espessura total de seis milímetros na superfície dorsal de cada camundongo. Coloque suavemente o andaime bioimpresso 3D contendo vesículas extracelulares marcadas com PKH no leito da ferida. Certifique-se de que o andaime cubra totalmente a superfície da ferida e pressione levemente com uma pinça estéril para minimizar as bolsas de ar. Transfira os camundongos anestesiados para o sistema de imagem IVIS duas horas, quatro horas, oito horas e 24 horas após o implante. No assistente de imagem, selecione a opção de imagem de fluorescência e ative os filtros de excitação e emissão para o corante PKH. Ajuste as configurações da câmera, incluindo o campo de visão e a altura do assunto para otimizar a detecção do sinal. Comece a adquirir imagens, salve os dados resultantes. Em seguida, libere os sinais fluorescentes dos EVs rotulados. Os EVs de alginato no andaime de alginato de carboximetilcelulose exibiram um perfil de liberação mais rápida em comparação com os EVs de alginato apenas em carboximetilcelulose, particularmente nos pontos de tempo de duas e quatro horas.