Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Nosso grupo de pesquisa usa álcool polivinílico, PVA e poli épsilon-caprolactona, PCL, membranas nanofibrosas para desenvolver um sistema de cocultura 3D. O objetivo é responder como as membranas suportam células epiteliais e de fibroblastos, mimetiza ambientes teciduais e facilita o estudo de padrões, sinalizações e interações celulares. Mostraremos que as membranas nanofibrosas porosas eletrofiadas permitem que as células epiteliais formem tecido epitelial, permitindo que multicamadas e fibroblastos cresçam em cada matriz adicional.

Os métodos destacam como um sistema 3D expandido pode fornecer ao tecido em crescimento melhores ambientes em comparação com as culturas tradicionais e 2D. Oferecemos um sistema de cocultura que emprega células epiteliais diferenciadas. A organização usando células-tronco requer um procedimento de diferenciação complexo, mas nosso modelo tem vantagens em simplicidade e economia de tempo no desenvolvimento de um sistema de cocultura 3D.

Nós nos concentramos em superar a limitação dos andaimes nanofibrosos combinando membranas nanofibrosas com hidrogéis de camada nas coculturas. Para começar, adicione 0,02 gramas de ácido poliacrílico e um grama de PVA a uma garrafa de vidro limpa contendo uma barra magnética. Adicione 7,8 mililitros de água destilada à garrafa e, em seguida, coloque-a em um agitador de pratos.

Assim que a garrafa esfriar até a temperatura ambiente, adicione 0,2 mililitros de glutaraldeído e coloque-a de volta no agitador de placas a 500 RPM por 30 minutos em temperatura ambiente. Use uma seringa de cinco mililitros para eletrofiação. Separe os êmbolos dos cilindros e limpe pequenos detritos de plástico dentro dos cilindros e das pontas dos êmbolos.

Em seguida, use agulhas para bloquear o fluxo de líquido e despeje a solução de PVA em cada corpo da seringa. Monte os êmbolos nos barris e remova as agulhas. Depois de montar uma nova agulha de metal de calibre 27, coloque-a na eletro máquina de fiar.

Enrole o coletor firmemente com papel alumínio. Assim que o painel injetor retornar à sua posição original, ajuste a eletrofiação para um volume de injeção de dois mililitros, taxa de injeção de seis microlitros por minuto, velocidade do rolo de 100 RPM e distância da ponta ao coletor de 14 centímetros. Verifique o fluxo de líquido para cada bomba e, em seguida, opere a eletrofiação com um potencial elétrico de aproximadamente 12 quilovolts.

Após a conclusão do processo de eletrofiação, retire a folha que contém o tapete de fibra do coletor. Armazene o tapete de nanofibra em um dessecante sob vácuo. Adicione 1,5 gramas de PCL e 8,5 mililitros de clorofórmio a uma garrafa de vidro limpa.

Coloque o frasco em um agitador de placas e dissolva o PCL em clorofórmio por 12 horas em temperatura ambiente. Corte um pequeno pedaço da membrana de nanofibra, cubra os pedaços com uma fina camada de ouro usando o processo de pulverização automática por cinco minutos. Para começar, corte o tapete de nanofibra de PVA fabricado em pedaços do tamanho desejado para o inserto transwell.

Prepare um pequeno prato contendo 1,5 mililitros de ácido clorídrico puro. Coloque o prato com ácido clorídrico e os pedaços de nanofibra dentro de uma câmara de vácuo e feche a tampa. Em seguida, abra a válvula conectada à bomba de vácuo e aguarde 10 segundos até que os vapores de ácido clorídrico subam.

Feche a válvula e trate as membranas com vapores de ácido clorídrico por dois minutos. Após o tratamento com ácido clorídrico, adicione gotas de água destilada às membranas. Coloque as membranas em uma lâmina de vidro e remova-as do papel alumínio.

Use um revestidor automático para revestir as membranas com fita de carbono com uma fina camada de ouro. Em seguida, lave as nanomembranas de PVA reticuladas com ácido clorídrico três vezes com PBS e mergulhe-as no meio de cultura. Após a imersão, verifique o pH para confirmar a ausência de ácido clorídrico residual.

Para começar, corte as esteiras de nanofibra em pedaços redondos com um diâmetro de 10 milímetros para nanomembranas de PVA e 13 milímetros para nanomembranas de PCL. Misture a base e o agente de cura SYLGARD 184 em uma proporção de massa de 10 para um em um copo plástico. Use uma lâmina de vidro limpa para misturar vigorosamente o polidimetilsiloxano, ou solução PDMS, por dois a três minutos até formar bolhas.

Espalhe o PDMS uniformemente em uma lâmina de vidro. Mergulhe bem a borda inferior do inserto levemente no PDMS. Em seguida, coloque o inserto bem de cabeça para baixo no aquecedor de lâminas por 10 a 15 minutos até que o PDMS endureça.

Verifique o PDMS com uma ponta de pipeta de 200 microlitros para garantir que não esteja mais pegajoso. Agora, pressione suavemente o inserto bem na peça de nanomembrana de PVA, de modo que a parte inferior do inserto fique bem voltada para o lado de nanofibra da membrana. Adicione uma gota de água destilada no centro do poço e use uma pinça para remover cuidadosamente o papel alumínio.

Em seguida, coloque bem o inserto em uma nova placa de 24 poços e deixe a membrana secar. Ao conectar a peça de nanomembrana, mergulhe uma ponta de pipeta de 200 microlitros na mistura PDMS e pontilhe-a precisamente nos quatro cantos e no centro do poço. Coloque a placa no aquecedor de lâminas e deixe o PDMS endurecer por cinco a sete minutos.

Em seguida, coloque a peça de nano membrana PCL no PDMS contendo bem com o lado da nanofibra preso ao PDMS. Use uma pequena escova limpa para pressionar levemente o lado da folha da membrana para uma fixação completa. Em seguida, adicione 0,2 mililitros de etanol a 70% ao poço para facilitar a remoção da folha.

Esterilize o inserto e o fundo bem na configuração do transwell sob luz ultravioleta durante a noite. No dia seguinte, lave bem o inserto e o fundo adicionando 200 microlitros de PBS ao inserto e 500 microlitros ao fundo por três ciclos de 10 minutos cada. Quando as células atingirem 70 a 80% de confluência, lave-as com 10 mililitros de PBS e adicione dois mililitros de 0,05% de tripsina EDTA para tripsiná-las.

Bata suavemente no prato para desalojar as células do fundo. Adicione oito mililitros de meio de cultura completo para neutralizar a enzima tripsina e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue o tubo a 400G por cinco minutos.

Depois de descartar o supranadante, ressuspenda o pellet celular em cinco mililitros de DMEM completo com meio F12. Em seguida, encha o poço inferior com 500 microlitros de mídia DMEM F12 completa. Transfira o inserto anexado à membrana nanofibrosa de PVA para o transwell e adicione 50 microlitros de suspensão de células MLE-12.

Em seguida, preencha o poço inferior da membrana nanofibrosa PCL com 500 microlitros de suspensão de células NIH3T3. Depois de incubar as células por duas horas, monte a célula MLE-12 contendo inserto e a célula NIH3T3 contendo o poço inferior na configuração do transpoço, A distribuição espacial das células NIH3T3 e MLE-12 no sistema de cocultura foi claramente distinguível, com células NIH3T3 verdes dispersas em profundidades variadas e células MLE-12 vermelhas formando camadas. As células NIH3T3 se infiltram na membrana nanofibrosa do PCL e se estendem ao longo dos eixos das nanofibras, enquanto as células MLE-12 aderem à superfície da membrana nanofibrosa do PDA e exibem uma agregação.