Name: Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprenda a estabelecer um sistema de cocultura 3D de células epiteliais usando membranas nanofibrosas de PVA e PCL. Este método simplifica o crescimento de tecidos e facilita o estudo de interações celulares em engenharia tecidual.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avançado de co-cultura 3D de duas camadas para células epiteliais e de fibroblastos

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% de tripsina / EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x penicilina / estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x solução</td><td>PBS LPS</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4% de paraformaldeído</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 conjugado ZO-1 anticorpo</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>diluente de anticorpos OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 kit de ensaio</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de células (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Vermelho CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Vidro de cobertura</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glicose</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Dessecador bases com flange plana, rosca</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>Tampa do dessecador de vidro DURAN e Torneira Daihan</td><td>Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>Torneira Duran, com Eixo de PTFE</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>Máquina de eletrofiação</td><td>NanoNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>Álcool etílico, Pure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de Scanner Confocal a Laser de Fluorescência K1-fluo</td><td>Nanoscope Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel/mount</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>Solução de glutaraldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Bico de metal 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td>Natureza república</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de ósmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Trava de Syringe_Lure de Plástico (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido acrílico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poli(álcool vinílico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Policaprolactona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Pure HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia Eletrônica de Varredura</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>Vidro deslizante</td><td>Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 conjunto</td><td>onisciência</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Leitor Multimodo</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Este protocolo descreve as etapas críticas para a cocultura de células epiteliais pulmonares MLE-12 e fibroblastos NIH3T3, construindo um modelo de duas camadas baseado em membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo é adequado para imagens de células vivas, imuno-histoquímica e análise quantitativa de endpoint de células cocultivadas. Outros tipos de células também podem ser utilizados otimizando a densidade celular e as condições de crescimento.
O MEV mostra a distribuição uniforme das nanofibras de PVA fabricadas sem qualquer formação de grânulos (Figura 2A). O diâmetro das nanofibras de PVA variou de 150 nm a 230 nm (180 ± 25 nm, média ± desvio padrão (DP)). As nanofibras em NMs de PCL eletrofiadas foram orientadas aleatoriamente e estruturalmente semelhantes ao colágeno (Figura 2B). A maioria das fibras em NMs de LCP tinha um diâmetro entre 300 nm e 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Assim, a membrana nanofibrosa de PVA tinha tamanhos de poros menores do que a membrana nanofibrosa de PCL.
Antes da semeadura, as células MLE-12 e NIH3T3 foram coradas com Cell-Tracker vermelho e verde, respectivamente, e foram monitoradas durante todo o processo de cocultura. Conforme mostrado na Figura 3, a distribuição espacial das células MLE-12 na câmara de inserção e das células NIH3T3 na câmara inferior pôde ser observada distintamente. A análise de empilhamento de foco revelou que as células NIH3T3 foram dispersas e detectadas em profundidades variadas (102 ± 20 μm), enquanto as células MLE-12 formaram camadas com espessura de 80 ± 10 μm. O MEV mostra a ligação das células às membranas. As células NIH3T3 infiltram-se na membrana nanofibrosa do PCL e estendem-se ao longo dos eixos das nanofibras, enquanto as células MLE-12 aderiram à superfície da membrana nanofibrosa do PVA e exibiram uma agregação (Figura 4). Em seguida, examinamos a organização do citoesqueleto das células NIH3T3 e MLE-12 por coloração com actina. As células NIH3T3 cultivadas na membrana nanofibrosa PCL mostram uma distribuição de projéteis de filamentos de actina semelhantes a células no tecido, e a coloração de actina em células MLE-12 cultivadas em membrana nanofibrosa de PVA mostra agregados redondos sem espalhamento celular (Figura 5).
A distribuição e o padrão de crescimento das células MLE-12 em monocultura e cocultura foram comparados. As células coradas com vermelho Cell-Tracker em monocultura nos NMs de PVA formaram agregados, mas as células em condição de cocultura mantiveram uma distribuição uniforme na membrana ( Figura 6A ). Em uma análise 3D de imagens de microscopia confocal, o padrão de crescimento de células MLE-12 cocultivadas nos NMs de PVA mostra adesão em camadas de células cultivadas à membrana com densidade celular mais confluente, em comparação com células cultivadas na ausência de fibroblastos (Figura 6B). Além disso, a adesão célula a célula e a expressão de oclusina zonal (ZO)-1 nas superfícies celulares (seta indicada), mas não de agregados celulares, foram mais evidentes na condição de cocultura do que na cultura sem fibroblastos (Figura 6C).
A proliferação de células nas membranas foi medida usando o ensaio CCK-8. A proliferação celular NIH3T3 e MLE-12 aumentou com o tempo (Figura 7). No entanto, taxas de crescimento de células mais baixas foram observadas nas membranas do que em uma placa de cultura (dados não mostrados). As células NIH3T3 e MLE-12 cocultivadas em NMs mostram uma taxa de crescimento estável em comparação com as células monocultivadas em uma placa de cultura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema para ilustrar o método de co-cultura de fibroblastos NIH3T3 e células epiteliais MLE-12 no sistema de duas camadas baseado em andaimes. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
Figura 2: Estrutura das nanofibras de PVA e PCL. (A) AS membranas nanofibrosas de PVA e (B) PCL foram produzidas por eletrofiação. A estrutura e o diâmetro das nanofibras são medidos por MEV das superfícies da membrana. Barras de escala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
Figura 3: Em um sistema de cocultura, a distribuição espacial de células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. As células NIH3T3 (4 × 105) foram coradas com Cell-Tracker Green, e as células MLE-12 (3 × 105) foram coradas com Cell-Tracker Red. As células semeadas foram cultivadas por 24 h e observadas usando uma imagem de empilhamento Z de um microscópio confocal. Os números são indicados em μm; As setas mostram dimensões com X (largura), Y (comprimento), Z (profundidade). Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
Figura 4: Adesão e morfologia de células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. As células foram cultivadas nas membranas por 24 h e observadas usando MEV com aumento de 2.000x. Barras de escala = 15 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
Figura 5: Fibras de estresse de actina em células NIH3T3 na membrana nanofibrosa PCL e células MLE-12 na membrana nanofibrosa PVA. Células NIH3T3 (4 × 105) e células MLE-12 (3 × 105 células) foram semeadas nas membranas nanofibrosas PCL e PVA, respectivamente. Após 48 h de cultura, as células foram coradas com faloidina-iFlour 488 e observadas por microscopia confocal. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona); FITC = isotiocianato de fluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
Figura 6: Padrão de crescimento de células MLE-12 cocultivadas na membrana nanofibrosa de PVA. (A) Células MLE-12 coradas de vermelho Cell-Tracker (3 × 105 células) foram semeadas na membrana nanofibrosa de PVA e cultivadas isoladamente (células -NIH3T3) e com células NIH3T3 em um sistema de duas camadas (+células NIH3T3) por 48 h. (B) Células MLE-12 monocultivadas e cocultivadas por 48 h foram coradas com Hoechst 33342 (azul) e Phalloidin-iFlour 488 e observadas usando um microscópio confocal. As imagens 3D são mostradas usando a função de superfície do software Imaris. (C) As células MLE-12 foram cultivadas por 48 h e marcadas com fluorescência com Phalloidin-iFlour 488 e anticorpo anti-ZO-1 (vermelho). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = álcool polivinílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
Figura 7: Taxa de crescimento das células em um sistema de cocultura de duas camadas. As células NIH3T3 (4 × 105) e as células MLE-12 (3 × 105) são cocultivadas pelo tempo indicado. O crescimento celular no inserto e no fundo é medido usando o ensaio CCK-8. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Estabelecimento de um módulo de cocultura tridimensional de células epiteliais usando membranas nanofibrosas

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Um método simples é descrita para analisar os efeitos da fibroblastos de tecido em associadas células epiteliais. A combinação deste método eo tridimensional de cultura de tecido pode facilitar a análise das células após o isolamento a partir de 3D. A técnica é aplicável a células de diferentes potencial maligno, permitindo estudo sistemático dos efeitos de estroma associado ao tumor em células tumorais.

Isolamento de células epiteliais mamárias de tridimensional Mixed-célula esferoidal co-cultura

Os avanços nas tecnologias de biomateriais permitem o desenvolvimento de construções tridimensionais do tipo multicelular. Desenvolvemos protocolos de eletrofiação para produzir três andaimes individuais para cultivar as principais células estruturais das vias aéreas para fornecer um modelo 3D in vitro da parede bronquíola das vias aéreas.

Adaptação do Processo Electrospinning para fornecer três ambientes únicos para um Tri-camadas<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo da parede das vias aéreas

Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.

Engenharia tridimensionais tecidos epiteliais incorporado dentro Matriz Extracelular

Modelos de cultura BICAMADA atuais não permitem para estudos funcionais em vitro que imitam o microambiente que na vivo . Usando o glicol de polietileno e um método de modelagem de óxido de zinco, este protocolo descreve o desenvolvimento de uma membrana basal de biomimetic ultrafinos com rigidez sintonizável, porosidade e composição bioquímica que imita pròxima na vivo matrizes extracelulares.

Cultura de células de hidrogel ultrafinos Porated elástico como uma membrana do porão biomimético para Dual

Aqui, apresentamos um protocolo para obter sistemas 3D-cultura na auto montagem de andaimes de peptídeo para promover a diferenciação de condrócitos articulares humanas condrossarcoma em tecido de cartilagem, como.

Cultivo de células de mamíferos em andaimes tridimensionais do Peptide

Este protocolo descreve o isolamento de células epiteliais de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana para determinar sua heterogeneidade e propriedades funcionais para possível aplicação em modelos clínicos e fisiopatológicos.

In Vitro Cultura das Células Epitelias de diferentes regiões anatômicas da membrana amniótica humana

O protocolo apresentado descreve o desenvolvimento e o uso de uma técnica de coloração de actina filamentosa à base de faloidina com microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) para visualizar a estrutura da camada celular aderente em canais de cultura dinâmica microfluídica e câmaras tradicionais de cultura estática de poço fixo. Essa abordagem auxilia na avaliação da confluência da camada celular, da formação da monocamada e da uniformidade da espessura da camada.

Preparação e avaliação estrutural de monocamadas de células epiteliais em um dispositivo de cultura microfluídica de tamanho fisiológico

As inserções de cultura de tecidos com membranas plásticas são o padrão ouro em laboratórios de cultura de células como suportes permeáveis para estabelecer camadas celulares e modelos de tecidos de barreira. Aqui, apresentamos um método simples para substituir a membrana plástica por uma membrana mais biologicamente relevante feita de uma proteína de seda de aranha funcionalizada recombinante.

Mímica de membrana basal nanofibrilar feita de seda de aranha funcionalizada recombinante em inserções de cultura de tecidos feitas sob medida

Um protocolo inovador de vedação para produzir lacres à base de silicone estanques para membranas de dispositivos de chip de Polidimetilsiloxano (PDMS). Destinado a laboratórios, configuração de modelos de chips e desenvolvimento de plataformas de chips em pequena escala. Demonstramos o protocolo usando membranas plásticas e de tecido nativo. Esse procedimento requer apenas PDMS, tolueno, mofo, membrana e uma câmara de vácuo.

Procedimento acessível de vedação de silicone chip-membrana para uma ligação flexível e confiável

Óptico com resolução de microscopia fotoacústica (OR-PAM) é uma tecnologia emergente capaz de imagem absorção óptica...

Tridimensional Optical resolução Microscopia Fotoacústica

Aprenda a estabelecer um sistema de cocultura 3D de células epiteliais usando membranas nanofibrosas de PVA e PCL. Este método simplifica o crescimento de tecidos e facilita o estudo de interações celulares em engenharia tecidual.

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